Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
2.1.3. Опс+/Опс--векторы: система альтернативного переноса
Группа Монсанто [11] разработала векторную систему опс+/опс~. Этот вектор, созданный на базе Ti-плазмиды окто-пинового типа pTiB652, изображен на рис. 4. Он содержит две правые граничные последовательности. После совместного культивирования и селекции канамицинустойчивых растительных клеток (разд. 3) обнаруживаются два типа переноса генетического материала в растительный геном: переносится либо целиком гибридная Т-ДНК (ограниченная справа дистальной граничной последовательностью), либо Т-ДНК, лишенная опухолевых генов (ограниченная справа проксимальной граничной
Система альтернативного переноса
Коинтеграция
„Полный перенос"
Совместное культивирование
<]{пн
Кап
spc/strr -)n0S ------[TfH~j-
tms
tmr
OCS -
„Неполный перенос”
Л
d-йн]-
kanr
spc/s1;rr
- N05
Рис. 4. Схема использования опс+/опс~-вектора для трансформации растительных клеток. Стрелками обозначены граничные последовательности Т-ДНК. ?/# — участок гомологии, обеспечивающий возможность рекомбинации. Опухолевые гены представлены tms и //иг [11]; OCS и JV05 — гены октопин- и но-палин-синтазы. Гибридный ген канамициновой устойчивости обозначен katir, бактериальный ген спектиномицин-стрептомициновой устойчивости (для селекции коинтегратов) — spc/strr. В результате реципрокной рекомбинации Ti-плазмиды (pTiB6S3) (А) и производной pMC>N120 (pMON128) (Б) образуется коинтеграт pTiB6S3::pMONl28 (В). После совместного культивирования и селекции канамицинустойчивых растительных клеток в геноме последних обнаруживаются как полные гибридные Т-ДНК (Г), так и Т-ДНК, лишенные опухолевых генов (Д). (Воспроизводится с любезного разрешения авторов работы [12].)
328
Глава 4
последовательностью). В последнем случае соответствующие трансформанты могут быть регенерированы в интактное растение.
2.2. Перенос плазмид в A. tumefaciens путем конъюгации
Получив желаемую рекомбинантную конструкцию — введя интересующий ген X в плазмиду pBR322 или ее производную, как описано в разд. 2.1,— необходимо далее ввести эту конструкцию в A. tumefaciens. Поскольку pBR322 не способна реплицироваться в A. tumefaciens, достигнуть цели можно только путем интеграции рекомбинантной pBR322 в Ti-плазмиду pGV3850. Перенос новой конструкции из Е. coli в A. tumefaciens осуществляется путем конъюгации.
Плазмиды семейства ColEl (так же, как pBR322) сами по себе не трансмиссибельны; их перенос может обеспечиваться по транс-схеме трансмиссибельными плазмидами la-типа, например R64drdll. Для конъюгации необходима также активность гена mob (кодируемого ColEl), продукт которого узнает специфическую сигнальную последовательность — Ьо/и-сайт.
В этой области располагается точка инициации переноса. Плазмида pBR322 сохранила bom-сайт, однако функции mob для нее должна обеспечивать по транс-схеме вспомогательная плазмида. Этой цели отвечает плазмида pGJ28; она содержит как собственный bom-сайт, так и область mob и совместима с pBR322. Совместимость плазмид означает, что pGJ28 и pBR322 могут одновременно реплицироваться в одной и той же клетке Е. coli. Таким образом, донорный штамм Е. coli, содержащий pGJ28, R64drdll и рекомбинантную pBR322, способен мобилизовать все три плазмиды в A. tumefaciens. R64drdll нестабильна в клетках A. tumefaciens, а ни одна из двух других плазмид вообще не может реплицироваться в этом хозяине. Используя описанную систему, Ван-Хауте с сотр. [18] показали, что рекомбинантная pBR322 переносится в клетки реципиентного штамма с частотой 4,5-10~3. В связи с тем что плазмида pBR322 не способна реплицироваться после переноса, в этих экспериментах использовалась гибридная конструкция: рекомбинантная pBR322 была встроена в нетрансмиссибельный немобилизуемый плазмидный вектор, обладающий способностью реплицироваться в клетках A. tumefaciens. В случае использования рекомбинантной pBR322, содержащей участок ДНК Ti-плазмиды длиной 3,3 т.п.н., частота стабильной интродукции составляла 6,7-10~6. Принимая частоту конъюгативного переноса равной 4,5* 10~3, получаем для частоты рекомбинационных событий величину 1,5-10~3, что эквивалентно 0,5-10~6 на одну пару оснований в зоне гомологии.
Рекомбинантная конструкция на основе pBR322, содержащая чужеродный ген X (pBR::X), сначала вводится в клетки
Таблица 1. Среды для культивирования бактерий
Количества веществ указаны в расчете на 1 л среды. Агаризованные среды готовят, добавляя агар (Difco) до 1,5%, если не указано отдельно. pH раствора доводят до 7,0 1 М NaOH.
Среда УЕВ
Дрожжевой экстракт (Oxoid) 1 г
Мясной экстракт (Lab Lemco, Oxoid) 5 г
Пептон (Difco) 5 г
Сахароза 5 г
MgS04-7H20 0,5 г
Среда LB
Бактотриптон (Difco) 10 г
