Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Наконец, не прикасайтесь к вашим ценным препаратам ДНК до тех пор, пока не убедитесь, что все стадии методики работают с максимальной эффективностью. Особое внимание следует
Использование Я,-векторов для конструирования библиотек ДНК_3F
обратить на стадию обработки фосфатазой (при ее наличии в-плане эксперимента) (см. разд. 18.3). Используйте максимально эффективные упаковочные экстракты.
8. Амплификация
Рост рекомбинантного фага в первом приближении не зависит от нуклеотидной последовательности содержащейся в нем-чужеродной ДНК, и если вектор и хозяин выбраны правильно (разд. 15 и 16), все участки генома будут представлены в фаговых частицах пропорционально. Если некоторые из рекомбинантов растут несколько быстрее или медленнее обычного, это может отразиться на размере бляшки, но огромное большинство рекомбинантных молекул даст начало бляшкам, даже самая малая из которых может быть зарегистрирована с помощью гибридизации.
Библиотеку, приготовленную для конкретной работы, можно упаковать, посеять на чашку, провести скрининг, а затем выбросить. Искомая последовательность либо будет обнаружена, либо в библиотеке ее не окажется. При необходимости можно упаковать большее количество ДНК и повторить скрининг. Если бы процедура клонирования была хорошо отработана, вероятно, следовало бы готовить только библиотеку одноразового пользования для решения определенной задачи. Расщепленные донор-ную и векторную ДНК можно было бы заморозить и использовать по мере необходимости. С другой стороны, когда под1 руками имеются свежие и надежно работающие ингредиенты, наверно целесообразно приготовить библиотеку многоразового использования.
Амплифицированные библиотеки сохраняют довольно высокий титр в течение нескольких лет [2], однако также не лишены недостатков. Они полезны не только как источник для получения многих генов в течение значительного времени, но и тогда, когда библиотека должна использоваться многократно, например при «прогулке по хромосоме» (разд. 12). Такие библиотеки удобны также для передачи другим исследователям. Главный недостаток амплификации состоит в том, что в ходе ее из-за дифференциального роста рекомбинантов содержание некоторых последовательностей в библиотеке может уменьшиться, и для успешного поиска интересующего нас клона понадобится скрининг большего числа негативных колоний (бляшек). Этот процесс, к сожалению, трудно оценить количественно, и о нем следует помнить, если искомый рекомбинант в библиотеке не обнаруживается. Непропорциональность числа клонов возрастает при конкурентном росте рекомбинантов в жидкой среде либо при большой плотности бляшек. В связи с этим амплификацию проводят, выращивая первичную библиотеку при:
32
Глава 1
относительно низкой плотности бляшек на агаровых чашках, когда индивидуальные бляшки хорошо различимы. Кроме того, можно рекомендовать начинать амплификацию с более чем «полной» библиотеки. При этом также уменьшается вероятность •одновременного заражения бактерии более чем одним рекомбинантным фагом, что может приводить к генетической рекомбинации между гомологичными повторяющимися элементами, присутствующими в разных вставках.
Амплификация с использованием дефектного по рекомбинации (Rec~) хозяина позволяет обойти эту трудность и свести к минимуму рекомбинационную нестабильность внутри клонированного фрагмента ДНК (разд. 16.2). Подробные сведения по амплификации рекомбинантных производных векторов EMBL можно найти в работе [6].
Для уменьшения гетерогенности бляшек по размеру и, следовательно, дифференциальной амплификации следует использовать свежую культуру хозяина, на которой фаг был предварительно сорбирован (см. разд. 13.2), и кроме того, поддерживать чашки в строго горизонтальном положении до тех пор, пока не застынет верхний слой агара. После инкубации поверхность агара заливают слоем L-бульона или фагового буфера и оставляют более чем на час при комнатной температуре либо на ночь при 4°С. Суспензию фага собирают пипеткой в центрифужную пробирку, добавляют несколько капель хлороформа и центрифугируют при низкой скорости для удаления остатков бактерий. Фаг титруют и хранят при 4°С. Условия длительного хранения фага обсуждаются в работах [1, 2]. Амплифициро-ванную библиотеку можно сконцентрировать с помощью равновесного центрифугирования в градиенте CsCl.
Амплифицировать такие библиотеки заново не следует, поскольку существует опасность избыточного роста субпопуляций относительно более жизнеспособных фагов.
9. Скрининг при помощи гибридизации
Если библиотека геномной ДНК получена, то гордый ее обладатель оказывается лицом к лицу с проблемой: как отыскать интересующую его последовательность среди 106 или бо^ лее независимых клонов? Задачу эту, при отсутствии какого-либо зонда или системы поиска, можно сравнить с поисками •иголки в стоге сена. В рамках данного раздела будем считать, что скрининг производится гибридизационными методами и имеются соответствующие ДНК- или РНК-зонды. Другие методы скрининга рассмотрены в разд. 10.
