Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
В большинстве случаев зонд представляет собой фрагмент • .ДНК, клонированный в плазмидном векторе и меченный путем ник-трансляции или другим способом. Следует заметить, что
Использование Я,-векторов для конструирования библиотек ДНК
33
ряд распространенных плазмидных векторов, например космиды и некоторые экспрессирующие векторы, содержат последовательности ДНК фага X. Если те же последовательности присутствуют в плечах рекомбинантных молекул ДНК, то идентификация нужного рекомбинанта становится практически невозможной. В таких случаях фрагмент-зонд необходимо очистить при помощи электрофореза в агарозном геле до или после мечения [2, 13] (см. также разд. 12).
Гибридизацию проводят не на самих бляшках, а, не разрушая их, на фильтрах-репликах, снятых с этих бляшек [2, 14]. Используют нитроцеллюлозные или нейлоновые мембранные фильтры. Фаговые бляшки содержат не только амплифициро-ванные частицы фага, но и значительные количества неупакованной, свободной фаговой ДНК. Эта ДНК, даже если она в некоторой степени повреждена, представляет собой неплохой субстрат для гибридизации. Чашку Петри или другой сосуд (использовались, в частности, пластиковые подносы) с агаром, на котором в слое верхней агарозы рассеяна некоторая часть библиотеки, накрывают стерильным фильтром соответствующей формы (круглым или прямоугольным), хорошо впитывающим влагу из агарозы. Фаговые частицы и свободная ДНК сорбируются на фильтре и, если поверхность агарозы не слишком влажна, при этом практически не размываются. Фильтр, снятый с агарозного слоя, несет на себе невидимую реплику картины расположения бляшек на его поверхности. Агарозу вместо агара для верхнего слоя используют потому, что в этом случае верхний слой не отстает от нижнего при снятии фильтра. Кроме того, при этом уменьшается неспецифическое связывание фильтром-репликой радиоактивного зонда.
С одной чашки можно получить несколько реплик. Для того чтобы денатурировать ДНК фага и закрепить ее на фильтре, реплики подвергают специальной обработке. Двухцепочечная ДНК не связывается с нитроцеллюлозой, а одноцепочечная, напротив, имеет к ней очень высокое сродство. При краткой обработке сильными растворами щелочи ДНК освобождается из фаговых частиц и денатурирует. При последующей обработке концентрированными буферными растворами pH становится ближе к нейтральному, однако ДНК остается в одноцепочечной форме и может быть необратимо фиксирована на фильтре запеканием при 80 °С. Фильтр «прегибридизуют» в растворе, компоненты которого насыщают его неспецифические ДНК-связы-вающие центры, а затем гибридизуют с радиоактивными одноцепочечными ДНК- или РНК-зондами. При температуре и концентрации соли, благоприятствующих ренатурации гомологичных или частично гомологичных последовательностей (обсуждается в работе [2]), часть молекул зонда свяжется с тем участком фильтра, который несет родственную зонду последо-
3—196
34
Глава 1
вательность. Закрепившаяся таким образом на фильтре радиоактивность сохраняется в процессе промывки не содержащими зонда растворами, и ее можно обнаружить при помощи радиоавтографии [2, 14].
Затем уже нетрудно совместить «положительный сигнал» с соответствующей бляшкой (или участком) на чашке с агаром. Гибридизационный сигнал будет находиться в одной и той же точке на фильтре — реплике и его дубликате, благодаря этому его можно отличить от точек неспедифического связывания зонда, иногда по форме напоминающих бляшки.
На поверхности агаровой чашки диаметром 90 мм можно различить от 500 до 1000 отдельных бляшек. Геном, близкий по размеру к геному Е. coli или дрожжей, может быть представлен «полностью» (р = 0,99) в библиотеке из 103—104 независимых рекомбинантов. Для полного рассева такой библиотеки достаточно, следовательно, от 2 до 20 чашек, имеющих диаметр 90 мм. В случае удачи положительный сигнал на фильтре-реплике (репликах) может совпасть с бляшкой, удаленной от соседних на такое расстояние, которое позволяет выделить интересующий нас клон в чистом виде.
Скрининг с низкой плотностью бляшек возможен даже для генома дрозофилы (3-104 рекомбинантов для р = 0,99), однако он неэкономичен для геномов млекопитающих или растений (3-105—3• IО6 рекомбинантов) как из-за высокой стоимости мембранных фильтров, так и из-за большого количества чашек. Поэтому скрининг больших библиотек обычно проводят при значительно большей плотности (104 и более бляшек на чашку диаметром 90 мм). При такой плотности бляшки почти сливаются, и найти и отобрать индивидуальную бляшку невозможно. В таких случаях из нужной области чашки вырезают столбик агара, фаг из него ресуспендируют в фаговом буфере и вновь рассевают в таком разведении, чтобы на поверхности чашки образовывалось 200—500 бляшек. С этих чашек вновь снимают фильтры-реплики, гибридизуют (для этого необходимо сохранить исходный зонд, см. разд. 18.10) и отбирают изолированные бляшки, совпадающие по положению с сигналами гибридизации.
Фаг может диффундировать вдоль поверхности агара, особенно после снятия с чашки фильтра-реплики. Поэтому на последней стадии, после скрининга как с высокой, так и с низкой плотностью, нужно очистить отобранную бляшку, рассеяв ее на отдельные колонии. Индивидуальную бляшку можно получить и при помощи посева штрихом [2]. Две случайно выбранные изолированные бляшки в конце штриха размножают для выделения из них ДНК.
