Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Гловер Д. -> "Клонирование ДНК. Методы" -> 9

Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.

Гловер Д. Клонирование ДНК. Методы — М.: Мир, 1988. — 538 c.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка): klonirovadnkdnkmetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 3 4 5 6 7 8 < 9 > 10 11 12 13 14 15 .. 253 >> Следующая

4.2. Реакция упаковки
Длина ДНК, упаковывающейся в головку фага, ограничена. как сверху (~52 т.п.н), так и снизу (~40 т.п.н). Варьируя методику приготовления упаковочного экстракта, можно изме-
Использование Я-векторов для конструирования библиотек ДНК
27
нять эффективность, с которой пакуются небольшие (~40т. п. н) геномы по отношению к геномам нормального размера [2, 11]. По методике II [2] получают экстракты, осуществляющие довольно жесткую селекцию молекул ДНК, близких по размеру к геному к дикого типа (т. е. вставки длиной ~20 т. п. н. при длине плеч 30 т.п.н). Эта методика оказывается полезной при работе со вставками наибольшего возможного размера, особенно если при получении донорных фрагментов не использовалось фракционирование. Более широкий спектр вставок, включающий вставки минимально возможной длины, можно получить с использованием методики I [2]. Сама по себе эта методика менее эффективна, чем методика II, однако при ограниченном количестве донорной ДНК с ее помощью можно получить максимальный выход рекомбинантов. Большая часть коммерческих экстрактов принадлежит к типу с жестким отбором.
4.3. Трансфекция
Коммерческие упаковочные экстракты весьма дороги. Библиотеки прокариотических геномов можно получать при помощи трансфекции (введения в бактериальную клетку свободной фаговой ДНК). Желательный субстрат для трансфекции — это мономерная молекула фаговой ДНК. Оптимальные условия лигирования для трансфекции, таким образом, отличаются от условий, необходимых для упаковки in vitro.
Даже, не учитывая концентрации ДНК, при выборе условий лигирования необходим компромисс. Тт для липких концов, образующихся при действии рестриктаз (4 нуклеотида), равна примерно 5°С. (Тт — это температура, при которой половина комплементарных оснований нуклеиновой кислоты в растворе отожжена). Обычно используемые ДНК-лигазы хорошо работают при 37 °С и малоактивны при 5°С. В условиях значительного избытка лигазы при температуре 10—16° лигирование проходит с приемлемой скоростью (от минут до часов). Отжиг липких концов фага К, требующий более высокой энергии активации, будет далек от равновесия после короткой реакции при низкой температуре. Таким образом, если ДНК плеч диссоциировать перед началом реакции (прогрев 10 мин при 68°С и ¦быстрое охлаждение во льду), основным продуктом лигирования будут линейные мономерные рекомбинантные молекулы ДНК, пригодные для трансфекции [11, 15]. Напротив, чтобы оптимизировать образование конкатенированных молекул, ДНК плеч необходимо заранее отжечь (разд. 18.9). В любом случае лигирование проводят при высокой концентрации ДНК, чтобы преимущественно происходило соединение молекул, а не внутримолекулярная циклизация.
28
Глава 1
5. Препаративная реакция
После того как определены условия лигирования, необходимо провести препаративную реакцию, чтобы получить нужное для полной библиотеки число рекомбинантных фагов и упаковать лигированную ДНК с наибольшей возможной эффективностью. К сожалению, эффективность, получаемая в аналитических опытах, достигается на этой решающей стадии редко, поэтому не стоит вкладывать всю имеющуюся фракционированную ДНК в один эксперимент.
Например эффективность, с которой различные партии упаковочных экстрактов пакуют молекулы фаговой ДНК, может не строго линейно зависеть от концентрации ДНК, особенно при высоких ее концентрациях. Если необходимо использовать содержимое нескольких пробирок с экстрактом, их следует использовать по-отдельности, так как объединение их обычно ведет к уменьшению эффективности (Дж. Вольф, личное сообщение). Лучше работать не более чем с двумя-тремя пробирками сразу, так чтобы экстракт не успевал полностью растаять при смешивании с ДНК.
После упаковки добавьте в пробирку каплю хлороформа, определите титр упакованного фага и храните библиотеку при 4°С. Избыток упаковочного экстракта может подавлять рост бактерий. Если титр библиотеки очень мал и необходимое для скрининга (разд. 9) или амплификации (разд. 8) число бляшек можно получить лишь при нанесении на чашку 1/10—1/4 объема упакованного фага, следует сконцентрировать упакованный фаг центрифугированием в градиенте CsCl [1, 2]. Условия длительного хранения фага X описаны в работах [1, 2, 15J; заметим, однако, что фаг, упакованный in vivo, дольше сохраняет жизнеспособность, чем препарат, полученный in vitro.
Несмотря на эти трудности, библиотеки фага X, насчитывающие больше 106 рекомбинантов, можно без особых затруднений получать из небольшого количества исходного материала, хотя, имея в виду сказанное выше, их скрининг и амплификацию сле^ дует проводить возможно быстрее.
6. Необходимый размер библиотеки
Считая, что выбор последовательности-вставки случаен, что все фрагменты донорной ДНК имеют одинаковую длину, и зная размер генома, нетрудно определить размер библиотеки, с заданной вероятностью включающей выбранную последовательность ДНК. На практике, хотя ни один из приведенных выше параметров точно не известен, можно получить приближенную цифру, достаточную для большинства случаев.
Предыдущая << 1 .. 3 4 5 6 7 8 < 9 > 10 11 12 13 14 15 .. 253 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed