Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
В следующем разделе мы рассмотрим подробно все этапы приведенной выше общей схемы. Так как многие из применяемых нами методов с достаточной полнотой описаны в других руководствах, мы будем отсылать читателя к этим источникам' [1, 2]. В данной главе особое внимание уделено тем этапам клонирования, на которых исследователя подстерегают ловушки, и предложены методы, помогающие их обойти. В особенности хотелось бы указать на важность постановки во всех возможных случаях контрольных экспериментов, позволяющих судить об успешном проведении каждой стадии клонирования.
3. Донорные и векторные ДНК
3.1. Выделение донорной ДНК
Донорная ДНК вне зависимости от источника должна удовлетворять основному требованию: ее молекулярный вес должен быть очень велик. Как правило, при выделении ДНК из клеток она несколько деградирует вследствие механических воздействий на нее в процессе выделения и расщепления ферментами, высвобождающимися при разрушении клеток. Эту деградацию необходимо сводить к минимуму, в особенности если набор до-норных фрагментов ДНК предполагается получать при помощи частичного расщепления рестриктазами, так как в противном случае значительная часть фрагментов не будет иметь липких концов. Такие фрагменты, непродуктивно соединяясь с фрагментами векторной ДНК, будут затруднять клонирование, поскольку к ним будет присоединяться лишь одно из двух необходимых для образования инфекционной рекомбинантной молекулы плеч фага. Кроме того, обычным субстратом для упаковки в инфекционные фаговые частицы in vitro служат конкатенированные молекулы фаговой ДНК (рис. 1,5, разд. 4.1). Молекулы же с «оторванным» концом будут останавливать рост цепи и, следовательно, затруднять как реакцию лигирования, так и упаковку.
2-196 С й (I ’? "I 1 # BlWuii ‘
IS
Глава 1
Все вышесказанное может быть не особенно важным при работе с небольшими геномами (например, геном Е. coli можно с достаточной полнотой представить библиотекой из 1000 индивидуальных рекомбинантов со вставкой длиной 20 т. п. н.), однако играет большую роль при конструировании сложных эукариотических библиотек, включающих до миллиона рекомбинантов. Эти обстоятельства необходимо учитывать и тогда, когда количество донорной ДНК ограничено. Как правило, для клонирования с высокой эффективностью^средний размер донорной ДНК должен существенно превосходить 100 т. п. н.
Идеальный метод выделения ДНК должен содержать минимальное число стадий и полностью исключать механическое дробление и ферментативную деградацию ДНК. Обычно механическое дробление ДНК происходит при излишне энергичном перемешивании вязких ее растворов, особенно при использовании многократных экстракций фенолом или другими органическими растворителями. Большинство методик выделения высокомолекулярной ДНК включает суспендирование сферопластов (для прокариот) или эукариотических ядер в стабилизирующем буфере и последующее добавление лизирующего реагента, переводящего ДНК в раствор. Использование для лизиса сильных детергентов позволяет не только солюбилизировать ДНК, но и подавить эндогенную ДНКазную активность.
Механические методы (например, гомогенизация) допустимы лишь до стадии лизиса. После лизиса раствор из-за присутствия высокомолекулярной ДНК становится вязким. Начиная с этой стадии, необходимо свести к минимуму все механические воздействия (перемешивание, встряхивание, продавливание через пипетки или иглы шприца), а число стадий, на которых возможно дробление, сделать по возможности небольшим. Смешивание при экстракции фенолом необходимо проводить осторожно (раздел 18.4)! Так как с высококонцентрированными и, следовательно, вязкими растворами ДНК работать весьма трудно, обычно предпочитают умеренные концентрации ДНК (<1 мг на 20 мл ядерного лизата) и в соответствии с этим выбирают количества исходного материала.
Метод, в который не входят экстракция фенолом и осаждение этанолом, а очистка и концентрирование ДНК проводятся одновременно при помощи равновесного центрифугирования в градиенте хлорида цезия (CsCl), описан в разд. 18.4. Этот метод, представляющий собой модификацию ранее описанного [27], был успешно использован для выделение высокомолекулярной ДНК из бактерий, грибов, дрозофилы, культивируемых клеток млекопитающих и тканей млекопитающих. Метод быстр, содержит минимальное число стадий и доступен исследователю, не имеющему большого опыта работы с высокомолекулярной ДНК.
Использование Я-векторов для конструирования библиотек ДНК
19*
3.2. Фракционирование донорной ДНК
Истинно случайное распределение фрагментов в библиотеке может быть достигнуто только тогда, когда ДНК фракционируют методом, не зависящим от нуклеотидной последовательности, например путем контролируемого механического дробления
[9]. Удобнее, однако, фракционировать ДНК при помощи частичного расщепления рестриктазой. Если выбранный фермент расщепляет ДНК до относительно небольших фрагментов (в сравнении с желаемым размером клонируемых фрагментов), обработка рестриктазой позволяет получить набор перекрывающихся фрагментов, в достаточной степени случайный для боль-шинства целей. Тем не менее невозможно гарантировать, что во фрагментах желаемой длины будут присутствовать все участ-ки генома, так как некоторые протяженные области генома могут, например, вообще не содержать участков расщепления. Более того, не все участки расщепления атакуются ферментом с равной эффективностью.
