Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
крипции на позднюю, синтезируются белки вириона, реплицированные геномы упаковываются, клетка лизируется и из нее освобождается около 100 инфекционных фаговых частиц. В умеренном цикле, напротив, большая часть функций фага остается репрессированной, прямо или косвенно, молекулами А-репрессо-ра, связанного с определенными участками промоторов рь и Pr. Если репрессия произошла до активации поздних генов, лизиса не происходит и может установиться лизогенное состояние. Для стабильной лизогении в отличие от абортивной необходима ин-
44
Глава 1
Рис. 7. Литический цикл развития бактериофага Я. ДНК фага можно ввести в бактериальную клетку либо в свободном виде (трансфекция), либо путем инфекции клетки фаговыми частицами. Внутри клетки ДНК при помощи своих липких концов замыкается в кольцо, и при действии ДНК-лигазы на теперь уже двухцепочечный cos-еайт образуется ковалентно замкнутая кольцевая молекула ДНК. В течение примерно 15 мин после инфекции репликация происходит двунаправленно (0-репликация) и образуется некоторое число мономерных кольцевых копий ДНК фага. Переход к репликации кольцевых матриц по механизму «катящегося кольца» в клетках Е. coli гесВС+ блокирован, если фаг не содержит функционального гена gam. Ген gam не обязателен для этого перехода, если нуклеаза гесВС дефектна. Продуктом репликации по типу «катящегося кольца» являются линейные конкатенированные молекулы ДНК — обычный субстрат для упаковки in vivo. Мономерные кольца не способны упаковываться. В ходе процессинга конкатенированной ДНК ферменты упаковки узнают два cos-еайта, разделенные промежутком нужной длины (40—52 т. п. н.), и расщепляют по ним ДНК с образованием липких концов. Полученный в результате зрелый линейный геном фага, ограниченный липкими концами, и входит в состав инфекционной фаговой частицы. Фаг, не содержащий гена gam, можно (хотя и не так эффективно) размножать в клетках гесВС+, если функционирует система общей генетической рекомбинации. Рекомбинация между мономерными кольцами приводит к появлению мультимерных кольцевых молекул, которые способны упаковываться.
теграция генома X в специфический участок хромосомы хозяина. В этом случае геном фага (профаг) будет реплицироваться вместе с хромосомой Е. coli. Все описанные в этой главе Л-векторы, однако, лишены гена репрессора и системы интеграции и поэтому неизбежно включаются в литический цикл.
При литическом пути развития активация поздних генов X обычно связана с изменением основного механизма репликации ДНК (рис. 7). В течение первых 15 мин после инфекции двунаправленная репликация ДНК приводит к образованию мономерных кольцевых дочерних молекул (0-тип репликации). Позднее основным продуктом репликации становятся линейные конкатенированные молекулы, образующиеся, видимо, по механизму «катящегося кольца». Конкатенированные геномы и являются субстратом для упаковки как in vivo, так и in vitro, при этом
Использование А-векторов для конструирования библиотек ДНК
45
EMBL3 S В R R В S
ill ill
Е MB 1.4 RBS SS SB'R
,__________________4^ [j 4/
I I red gam trpE | N |
20,3 13,7 9,2
€h34
Ch35
Б R Ss(Sm)XS(P]H В В H P S X(Sm)SsR S
I I E.coli ДНК I gamN |
19,5 16,5 (34) 10,7
15,6(35)
Рис. 8. Описанные в тексте векторы замещения. Указаны длины плеч и центральных фрагментов в т. п. н. А. Векторы EMBL3 и EMBL4 получены в несколько этапов из вектора 1059 [29]. Вектор 1059 не имел полилинкера, а его центральный фрагмент содержал последовательности плазмиды ColEI, поэтому при скрининге библиотек на основе 1059 плазмидными зондами фоновая гибридизация за счет последовательностей родительского фага значительно осложняла работу. Для устранения этих трудностей в центральный фрагмент EMBL3 И EMBL4 включены те же последовательности X, что и в центральный фрагмент 1059 (некоторые из них дуплицированы в правом плече), но присоединенные вместо ColEI к гену trpE E.coli К12. Б. Векторы Харон 34 и 35 [8] различаются только центральным фрагментом. Их полилинкеры (60 п. н.) содержат несколько сайтов рестрикции, однако некоторые из этих сайтов содержатся и в плечах вектора. Донорные фрагменты, клонированные в уникальных сайтах расщепления ?coRI, Ss/I, Xbal, Hind III и ВатШ, могут быть вырезаны из рекомбинантных молекул только по сайтам полилинкера. Клонирование возможно и по сайтам Sail, при этом используется сайт Sail, имеющийся в правом плече. Сайты полилинкера для Stnal и Pstl, которые нельзя применять для клонирования, пригодны для вырезания вставки. Эти четыре вектора представляют собой результат многолетней генетической и биохимической работы с геномом X. Полная информация об их структуре содержится в оригинальных работах. Без такой информации невозможно сколько-нибудь точное предсказание рестриктных карт. Такие карты (в ряде случаев проверенные экспериментально) для многих часто используемых рестриктаз можно найти в работах [61 и [8]. Все векторы, представленные на рис. 8, имеют генотип с1~ {ДКН54) и делецию nin 5, удаляющую участок терминации ts2 (рис. 6). Сокращенное обозначение участков рестрикции: В — BatnHl, Н — ffindlll, Р — Pstl, S—Sail, Sm — Smal, Ss— Ssfl, X — Xbal. EMBL3 и EMBL4 хранятся в Американской коллекции типовых культур.
