Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Не все бляшки, идентифицированные при помощи зондов б и в, необходимо анализировать на уровне ДНК, так как часть из них будет соответствовать бляшкам, уже идентифицированным зондом а, что дает возможность «путешествовать» преимущественно в нужном направлении. Кроме того, скрининг массива можно проводить одновременно с нескольких начальных точек.
Для сохранения массива в рабочем состоянии его необходимо либо перекалывать через каждые два месяца, используя эталонную чашку, либо изготовить трафарет для пересева бляшек с чашки на чашку. Хотя подготовка эталонной чашки —
42
Глава 1
весьма трудоемкая процедура, простота репликации такой чашки с помощью трафарета может компенсировать затраты труда по получению массива клонов для библиотеки генома, сходного по размеру с геномом дрожжей или даже дрозофилы. Этот метод позволяет картировать бактериальные геномы одновременно с нескольких участков. Многократная репликация и (или) длительное хранение библиотеки могут привести к размножению на бляшках устойчивых к фагу К клеток Б. coli, а также к появлению на чашках многочисленных цветных колоний других бактерий или грибов. В какой-то степени этого можно избежать, обрабатывая поверхность эталонной чашки перед хранением или использованием репликационного трафарета, парами хлороформа.
13. Бактериофаг X
13.1. Некоторые сведения по биологии фага %
Линейный геном фага К упаковывается в икосаэдрическую головку, от которой отходит отросток, заканчивающийся хвостовой нитью — продуктом гена / (этот ген детерминирует круг бактерий-хозяев). Фаг Я, если его хранят при 4°С в фаговом буфере или L-бульоне, содержащем 1—10 мМ MgSC>4, и в хорошо отмытой от детергентов посуде, не теряет свою инфекци-онность в течение нескольких лет. Концом своей хвостовой нити частицы фага прикрепляются к рецепторным участкам внешней мембраны клеток. Эти рецепторы, кодирующиеся геном lamB Е. coli, необходимы также для поглощения клеткой мальтозы, и их количество возрастает при выращивании клеток в среде, содержащей в качестве источника углерода мальтозу, но лишенной глюкозы для того, чтобы избежать катаболитной репрессии. Адсорбция не зависит от температуры и усиливается в присутствии ионов магния. Внедрение фаговой ДНК в клетку, зависящее от компонентов внутренней мембраны, напротив, протекает быстро при 37°С и медленно при низких температурах.
После того как геном % проникает в клетку, он замыкается в кольцо при помощи липких концов и превращается в ковалентно замкнутую кольцевую молекулу. Эта молекула и становится субстратом как для репликации (рис. 7), так и для транскрипции. Фаг Л — умеренный фаг, который может вступать как в продуктивный (литический), так и в умеренный (лизогенный) циклы. В обоих случаях транскрипция, начинающаяся с двух «ранних» промоторов pL и pR (рис. б), приводит к появлению функций, ответственных за репликацию ДНК, генетическую рекомбинацию, установлению лизогенного состояния и активацию транскрипции поздних генов. В ходе продуктивного (литического) цикла происходит переключение с ранней транс-
Использование А-векторов для конструирования библиотек ДНК
43
Головка фага Отросток
Регуляция ранней Регуляция поздней транскрипции транскрипции Рен ом бинация Репликация Лизис
А
N cl ОР
Q S R
Ъ
Б
я:
»L PL°L______________
¦ > • ¦ ¦
°rPr *Н 1 *Н2
PR*
ъ
Рис. 6. А. Гены, кодирующие связанные между собой функции, расположены в одной области фагового генома. Зачерненные области не обязательны для размножения фага и в процессе конструирования описываемых в этой главе векторов (рис. 8) были удалены. Заштрихованный участок также необязателен, если отсутствует сайт терминации tRz (см. ниже). Ген cl, кодирующий Я-репрессор, у описанных здесь векторов делегирован, поэтому и векторы, и их рекомбинантные производные размножаются только по пути лизиса (рис. 1.7). Б. Транскрипция генома начинается с промоторов рь и pR. В начале инфекции инициированные на pL и pR транскрипты (1) терминируются соответственно в участках tl и ^r1 (некоторые из транскриптов pR «проскакивают» /и1 и терминируются на ^r2). Это приводит к появлению продукта гена Nt в результате действия которого транскрипция перестает терминироваться на tt и <r1 и продолжается в область прилежащих к ним генов (2). При этом включается синтез продукта гена Q, в присутствии которого на /V начинается транскрипция «поздних» генов (3). В результате, этого считываются гены лизиса, cos-сайт (транскрибируется кольцевой геном, см. рис. 7), гены головки и отростка, вплоть до гена 1 хвостовой нити. Таким образом, ген N и его продукт в норме необходимы для активации поздних генов. Однако, если делегирован, к появлению продукта Q приводит независимая от гена N «утечка» транскрипции через tR 1. У большинства А,-векторов, включая описанные здесь, для увеличения максимального размера вставки произведена делеция (т'лб), захватывающая tRi. В результате этой делеции фаг может расти и в отсутствие гена N и промотора рь. Изображенные на рис. 8 векторы и их рекомбинантные производные имеют генотип N+ и потому не зависят от «утечки» транскрипции. 0 — главные промоторы; ¦ — главные сигналы терминации.
