Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Гловер Д. -> "Клонирование ДНК. Методы" -> 15

Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.

Гловер Д. Клонирование ДНК. Методы — М.: Мир, 1988. — 538 c.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка): klonirovadnkdnkmetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 9 10 11 12 13 14 < 15 > 16 17 18 19 20 21 .. 253 >> Следующая

Удельные активности, достаточные для скрининга библиотек фага % (не более 2-105—1-106 расп./мин/мкг), можно получить путем достройки л’ипких концов, оставшихся после расщепления рестриктаза ми, при помощи большого фрагмента ДНК-полиме-разы I Е. coli (концевая метка). В каждый из концов можно ввести от 1 до 4 дезоксинуклеотидов, меченных 32Р. Если концы расщепленной рекомбинантной ДНК пометить до электрофореза, выделенный из геля фрагмент можно сразу использовать в качестве зонда. Это позволяет избежать трудностей, связанных с присутствием в агарозе загрязнений, мешающих ферментативным реакциям (например, достройке концов).
В большинстве случаев небольшой участок линкера, остающийся в зонде, гибридизуется с присутствующими в каждом рекомбинантном фаге гомологичными последовательностями очень слабо и не приводит к появлению неспецифического фона. Следует отметить, однако, что участок ?coRI в линкере векторов Харон 34 и 35 отстоит на 55 п. н. от участка клонирования (ВатШ) (см. рис. 8). Этого может быть достаточно для появления заметного и иногда мешающего фона.
Общий подход для «прогулки по хромосоме» состоит в следующем.
1. Проводят скрининг библиотеки ДНК-зондом с уникальной последовательностью (зонд а, рис. 5). Несколько бляшек, совпадающих по положению с сигналами гибридизации, собирают, очищают и содержащиеся в них фаговые частицы размножают в небольшом количестве. ДНК фагов выделяют и анализируют
40
Глава 1
с помощью расщепления рестрикгазами и электрофореза в агарозе. Так как зондом служила уникальная последовательность, все эти ДНК должны содержать сходные последовательности в гомологичной зонду области. В этом можно убедиться с помощью переноса по Саузерну [12, 13], используя тот же зонд. Обычно это дает возможность идентифицировать перекрывающийся набор вставок и выявить в некоторых вставках фрагменты (например, фрагменты б и в на рис. 5), лежащие на границах клонированной области. Анализ упростится, если перед электрофорезом произвести отжиг ДНК плеч Л-вектора.
2. Так как фланкирующие вставку сайты рестрикции сохраняются в рекомбинантных молекулах, вставки бив легко отделить от плеч фага. Фаговые частицы, содержащие эти фрагменты, размножают, выделяют из них ДНК, фрагменты бив элюируют из геля и вводят в них радиоактивную метку. Используя эти фрагменты в качестве зондов для скрининга библиотеки, получают два новых набора перекрывающихся клонов, которые анализируют так же, как и первый набор. Концевые фрагменты гид выделяют и используют как зонды для дальнейшей идентификации перекрывающихся клонов (рис. 5).
3. Эта простая, хотя и долгая процедура усложняется присутствием повторяющихся последовательностей ДНК, таких, как транспозоны бактерий, сорш-подобные элементы или Alu-после-довательности. В приведенной на рис. 5 схеме присутствует несколько повторяющихся последовательностей (обозначены зачерненными прямоугольниками). Вставка, из которой получен зонд б, по счастливой случайности перекрывает один из этих элементов. Зонд д, однако, содержит повторяющуюся ДНК и будет реагировать на вставки из участков генома, содержащих другие последовательности данного семейства. Этого можно избежать, взяв в качестве зонда фрагмент е, и таким образом «перепрыгнуть» через повторяющийся элемент в область ДНК с уникальной последовательностью. Такой подход, однако, имеет ограничения, так как с его помощью нельзя преодолеть длинные (>20 т.п.н.) участки повторяющейся ДНК (если только не использовать космидную библиотеку). К счастью, элементы повторяющейся ДНК такой длины встречаются нечасто. Как правило, повторяющиеся элементы можно распознать в рекомбинантных фагах с помощью гибридизации, а во фрагментах фаговой ДНК — при помощи переноса по Саузерну с использованием в качестве зонда тотальной меченой ДНК генома [19].
Иногда трудности, вызываемые присутствием повторяющихся последовательностей, можно преодолеть, используя гетерогенность этих последовательностей в различных природных изоля-тах Drosophila melanogaster [20]. «Прогулку», начатую на хромосомах одной линии мух и прерванную повторяющейся последовательностью, можно иногда продолжить на другой линии.
Использование Я-векторов для конструирования библиотек ДНК
41
не имеющей в этом участке хромосомы повторяющейся ДНК, хотя сходные последовательности и имеются в других участках генома. Полиморфизм как в участках узнавания рестриктазами, так и в последовательностях-вставках может встретиться и в пределах одной библиотеки, если донорная ДНК была выделена не из инбредной линии.
В общем случае трудности «прогулки» в пределах данного участка хромосомы прямо пропорциональны частоте, с которой встречаются в нем повторяющиеся последовательности ДНК. Особенно утомительна «прогулка» по хромосомам высших растений и животных. В геноме человека, например, AIu-последо-вательности встречаются в среднем через каждые 10 т. п. н.
4. «Прогулка» по небольшому геному, такому, как Е. coli (<103 бляшек для р = 0,99), быстрее всего может быть осуществлена путем повторного скрининга одного и того же упорядоченного массива бляшек. Нет необходимости заново рассевать библиотеку для каждого нового скрининга. Упорядоченный массив из 1000 независимых бляшек можно создать на поверхности культуральной чашки размером 20-20 см путем осторожного переноса бляшек с помощью зубочисток. С такой эталонной чашки снимают несколько реплик. Одну из них используют для начального скрининга (зонд а). Бляшки, продемонстрировавшие положительные сигналы и хорошо отделенные от соседних бляшек, можно отобрать и размножить сразу, без дальнейшей очистки фага, особенно если одновременно с первым массивом создать другой, реплики с которого не снимаются. Неспецифические фоновые пятна и другие артефакты гибридизации в случае упорядоченного массива бляшек не вызывают особых затруднений, так что можно обойтись только одной репликой для каждого зонда (нитроцеллюлозные фильтры дороги). Вторую и третью реплики используют для скрининга зондами б ив. Каждую реплику можно использовать для скрининга несколько раз. Если чашку держать герметически закрытой и в перевернутом положении (для того чтобы конденсат не попадал на поверхность агара) при 4°С, фаг останется жизнеспособным в течение нескольких месяцев.
Предыдущая << 1 .. 9 10 11 12 13 14 < 15 > 16 17 18 19 20 21 .. 253 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed