Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Гловер Д. -> "Клонирование ДНК. Методы" -> 14

Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.

Гловер Д. Клонирование ДНК. Методы — М.: Мир, 1988. — 538 c.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка): klonirovadnkdnkmetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 8 9 10 11 12 13 < 14 > 15 16 17 18 19 20 .. 253 >> Следующая

11. Анализ рекомбинантных молекул ДНК
Выделив один или большее число рекомбинантных фагов по-их биологическим или гибридизационным свойствам, необходимо' получить характеристики их генома для того, например, чтобы установить точную структурную связь с зондом и друг с другом,.
Использование Х-векторов для конструирования библиотек ДНК
37
Рис. 5. «Прогулка по хромосоме». С клонированного fcoRI-фрагмента, не содержащего повторяющихся последовательностей (фрагмент а), начинают «прогулку» по содержащей этот фрагмент хромосоме в обоих направлениях. Вертикальными линиями обозначены сайты рестрикции Sail, имеющиеся как внутри фрагментов, так и на их концах (в составе полилинкера) и позволяющие точно отделять вставки от векторной ДНК. Зачерненные прямоугольники представляют собой относящиеся к различным семействам повторяющиеся последовательности. Другие последовательности тех же семейств находятся в отдаленных участках этой или других хромосом. С помощью зонда а идентифицируют набор перекрывающихся вставок в рекомбинантных молекулах ДНК фага. На рисунке показаны только сами вставки. Фрагменты бив, лежащие на концах клонированной области, используют для выявления еще двух наборов перекрывающихся вставок. Процесс продолжают, используя фрагменты г и е. Фрагмент д непригоден для дальнейшего скрининга, так как содержит повторяющиеся последовательности и приводит к «разветвлению пути». Очень длинный участок повторяющейся ДНК (вблизи правого конца) можно преодолеть лишь с использованием космидной библиотеки.
а также разработать стратегию субклонирования, позволяющую провести дальнейший анализ и использование полученных клонов. Методы выделения большого количества Х-ДНК и ее анализа (рестрикционный анализ, гетеродуплексный анализ, агарозный гель-электрофорез, перенос по Саузерну и т. п.) описаны в работах [1, 2, 13, 15, 16, 17]. Мы остановимся только на нескольких моментах, имеющих отношение к анализу рекомбинантов.
1. Первый шаг в описании рекомбинантной молекулы ДНК—• это чаще всего составление ее «рестриктной карты», указывающей положение участков узнавания рестриктазами, расщепляющими ДНК-вставку с небольшой частотой (обычно это ферменты, узнающие гексануклеотидную последовательность ДНК). Указанная задача решается проще, если имеется набор перекрывающихся клонов, так как именно области перекрытия между любой парой вставок дают информацию о взаимном распо-
38
Глава 1
ложении в них тех или иных фрагментов рестрикции (рис. 5). Использование ферментов, расщепляющих оставшийся в рекомбинантах участок полилинкера (например, Sail для вектора EMBL3, рис. 4), позволяет идентифицировать крайние фрагменты вставки. Эти фрагменты, в отличие от лежащих внутри вставки целиком, будут изменяться по размеру от клона к клону (вследствие «случайного» характера фрагментации генома). Если скрининг проходил при высокой плотности бляшек и в Кес+-хозяине, важно иметь в виду, что возможны изменения во взаимном расположении участков ДНК внутри вставки (разд. 9).
2. Имеются олигонуклеотидные последовательности, комплементарные каждому из выступающих «липких концов» Л-ДНК.
Их можно использовать для мечения любого из концов генома. Этот метод используется для быстрого получения рестриктных карт с помощью «лестницы» продуктов неполного расщепления [18], получаемой после их разделения электрофорезом. Лестницу можно читать с любого из концов генома. Такой анализ, очевидно, будет затруднен, если участки расщепления присутствуют и в плечах фага, а также если во вставке имеется несколько сближенных друг с другом участков расщепления. Векторы, cos-поеледовательности которых расположены вблизи тех участков, по которым производилось клонирование, позволяют получать большее разрешение.
3. В центральном фрагменте векторов EMBL имеется гомология с правым плечом векторной ДНК [6]. Это может привести к путанице в результатах при анализе гетеродуплексов между рекомбинантными молекулами и вектором (Делиус, личное сообщение). Поэтому, если необходим контроль для гетеро-дуплексного анализа, лучше использовать рекомбинантную, а не векторную ДНК.
12. «Прогулка по хромосоме»
Полученные описанными выше методами библиотеки идеально подходят для «прогулки по хромосоме» [19, 20] по двум причинам. Во-первых, они содержат перекрывающийся набор равно представленных фрагментов геномной ДНК, и поэтому теоретически любая точка хромосомы может быть пройдена в ходе «прогулки» от любой другой точки той же хромосомы. Во-вторых, сайты рестрикции, прилежащие к ЛатНЬучасткам вектора, в рекомбинантных молекулах сохранены. Например, к сайтам рестрикции ВатШ в векторе EMBL3 снаружи прилегают участки Sail (рис. 4). Таким образом, при помощи Sail можно точно отделить ДНК-вставку от плеч фага. Иногда дополнительные сайты Sail имеются и в самой вставке. Однако в любом случае можно идентифицировать специфический фраг- <
Использование Я-векторов для конструирования библиотек ДНК
39
мент (Sail—Sail или Sail—X, где X означает другой фермент, расщепляющий внутри вставки), который можно использовать в качестве зонда для поиска родственных клонов в библиотеке. Если используемые в качестве зонда фрагменты содержат последовательности конца или начала вставки, с них можно начать «прогулку» в обоих направлениях от области генома, содержащейся в исходном рекомбинанте (рис. 5). (Рестриктаза BamHl непригодна для отделения плеч от вставки, так как только один из четырех гибридных сайтов узнавания ВатШ/ /Sau3A расщепляется этим ферментом.) Внутри полилинкера любого из показанных на рис. 8 векторов можно выбрать участки расщепления, позволяющие разделить ДНК вектора и вставки. Выбранные в качестве зонда фрагменты можно очистить от ДНК плеч % и других нежелательных последовательностей, пе-реклонировав их в плазмиде, не имеющей гомологии с Х-ДНК. Этот фрагмент также можно очистить элюцией или экстракцией из агарозного геля одним из методов, описанных в работах [2] или [13]. В тех случаях, когда неудачное расположение участков рестрикции не мешает отделению зонда в геле от нежелательных фрагментов, разумнее использовать второй метод, поскольку он занимает меньше времени.
Предыдущая << 1 .. 8 9 10 11 12 13 < 14 > 15 16 17 18 19 20 .. 253 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed