Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Гловер Д. -> "Клонирование ДНК. Методы" -> 7

Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.

Гловер Д. Клонирование ДНК. Методы — М.: Мир, 1988. — 538 c.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка): klonirovadnkdnkmetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 2 3 4 5 6 < 7 > 8 9 10 11 12 13 .. 253 >> Следующая

22
Глава 1
А О
10
I
20
I
30 40 43,2 т.п.Н.
' 1 i
S В Е SS
чи н
ГС05~
Лев. плечо
Е В S
.ентральный фрагмент I Пр. плечо
~cosl
Рестрикция Ват HI
S
ICOS^
Лев. плечо
J GATC
CTAG
____________
Пр. плечо "Igg,
Е SS
GATC
I I
GTCGACGGATCCGGGGAATTC-----------
CAGCTGCCTAGGCCCCTTAAG-----------
t t t
Sail Ваш HI EcoRl
(s) (в) (E)
Рис. 4. А. Молекула ДНК типичного вектора замещения EMBL3. Центральный фрагмент окружен полилинкерами (Б) в инвертированной ориентации. Центральный фрагмент содержит два сайта рестрикции для SalI, а полилинкеры — сайты для Sail (S), Ват HI (В) и ?coRI (Е). Следовательно, EMBL3 пригоден для клонирования фрагментов ДНК с концами, комплементарными концам, образующимся при действии любого из этих ферментов. Одноцепочечные выступы длиной в 4 нуклеотида, появляющиеся при действии рестриктазы ВатШ. (GATC), дают возможность лигировать с этим вектором фрагменты донорной ДНК, образующиеся при частичном расщеплении Sau3A. Сохраняющиеся в плечах сайты для Sa/I позволяют вырезать фрагмент-вставку с минимальным захватом последовательностей векторной ДНК. Присутствие сайтов для ЕсоШ обеспечивает возможность инактивировать центральный фрагмент перед лигированием с донорными фрагментами. Cos — обозначает липкие концы фага X. Б. Последовательность ДНК, соответствующая области полилинкера EMBL3.
3.3. Векторная ДНК
Структура молекулы ДНК типичного вектора замещения (EMBL3) приведена на рис. 4, А. Центральный фрагмент окружен двумя необходимыми для размножения фага последовательностями. Левое плечо кодирует белки вириона, а правое — участок начала репликации, основные промоторы и ряд других важных генов. ДНК изображена в линейной форме, т. е. именно в той форме, в какой ее выделяют из фаговых частиц. На своих концах оба плеча несут короткие (12 нуклеотидов) комплементарные одноцепочечные участки (cos). Их называют липкими
Использование Я-векторов для конструирования библиотек ДНК
23
концами (cohesive ends). Наличие таких концов позволяет геному фага К после инфекции замыкаться в кольцо; при упаковке ДНК в фаговые частицы липкие концы образуются вновь.
Центральный фрагмент EMBL3 окружен полилинкерами {рис. 4, Б) в противоположных ориентациях:
Sall-BamHl-EcoRl—центральный фрагмент—EcoRl-BamHl-Sall.
В состав полилинкеров, длина которых менее 40 п. н., входят сайты узнавания для этих трех ферментов, единственные во всей молекуле вектора (за исключением двух дополнительных участков Sail в центральном фрагменте), поэтому любой из этих ферментов может быть использован для клонирования. Вектор, однако, предназначен специально для клонирования в сайте ВатШ. Эта рестриктаза расщепляет (с образованием липких концов) шестинуклеотидную последовательность:
g'gatcc
CCTAGp
Любая шестинуклеотидная последовательность, однако,' встречается в случайной последовательности ДНК лишь в среднем через каждые 4б (4096) пар нуклеотидов, что слишком редко для «случайного» расщепления донорной ДНК. Однако центральная часть последовательности, узнаваемой ВатШ:
'gatc
CTAGj
представляет собой сайт узнавания (точки расщепления указаны стрелками) для рестриктаз Sau3A и Mbol. Таким образом, расщепленная с помощью ВатШ. ДНК EMBL3 может акцептировать экзогенные фрагменты ДНК, полученные при частичном расщеплении рестриктазами Sau3k или Mbol (разд. 3.2 и 18.5). Образующиеся рекомбинантные вставки будут окружены с обеих сторон (фланкированы) расщепления для Sail, что позволяет точно отделить эти вставки от плеч вектора и использовать в качестве зонда для поиска перекрывающихся или родственных рекомбинантных фагов в библиотеке (разд. 12).
Все сказанное относится и к другим описанным здесь векторам, хотя структура линкеров в них может быть другой (см. рис. 8). Все линкеры содержат сайт расщепления для ВатШ, с обеих сторон которого расположены сайты узнавания для общедоступных рестриктаз. Кроме того, все эти векторы могут использоваться и для клонирования фрагментов, полученных с применением других ферментов (для EMBL3, например, это ?coRI и Sail). Такой подход может оказаться полезным, если
24
Глава 1
известно, что искомая последовательность входит в состав ?coRI- или Sa/I-фрагментов подходящей длины (9—22 т.п.н). Однако по-настоящему представительную и, следовательно, применимую для многих целей библиотеку таким способом получить нельзя.
Качество векторной ДНК (его легче проконтролировать) играет не менее важную роль, чем качество донорной ДНК. Известно несколько методов получения фаговых частиц в больших количествах (>100 мкг) (см. работы [1] и [2]). При выделении вектора, так же как и при выделении донорной ДНК, не следует увлекаться количеством исходного материала. С получающимися при этом концентрированными и, следовательно, вязкими растворами ДНК трудно работать. Кроме того, даже после многократной экстракции фенолом эта ДНК хуже поддается расщеплению ферментами. Наиболее чистые препараты фагов получают путем двукратного центрифугирования в градиенте плотности CsCl. После удаления CsCl диализом концентрат фага разбавляют и для освобождения фаговой ДНК несколько раз осторожно экстрагируют фенолом или смесью фенол : хлороформ : изоамиловый спирт (25:24:1) [6]. Фенол следует удалять интенсивным диализом, а не с помощью осаждения и промывки этанолом, так как осадок конкатенированной ДНК труднорастворим. Следует тщательно поддерживать стерильность растворов фаговой ДНК, так как ее одноцепочечные липкие концы весьма подвержены деградации, а их целостность необходима при клонировании.
Предыдущая << 1 .. 2 3 4 5 6 < 7 > 8 9 10 11 12 13 .. 253 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed