Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Векторную ДНК перед клонированием необходимо проверить несколькими методами. Особое внимание следует обратить на пункты, перечисленные в разд. 18.7.
3.4. Удаление центрального фрагмента
Если генетическая селекция против нерекомбинантных фагов невозможна или нежелательна, из препарата рестрицированной векторной ДНК перед лигированием с фрагментами донорной ДНК можно эффективно удалить центральный фрагмент. Подавляющая часть жизнеспособных фаговых геномов после этого окажется рекомбинантной.
Отделение плеч вектора от его центрального фрагмента можно осуществить либо при помощи фракционирования в градиентах хлористого натрия или сахарозы, либо посредством элюции или экстракции из агарозного геля. По причинам, указанным в разд. 3.2, мы предпочитаем первый метод. При любом методе выделения необходимо тщательно проследить, чтобы плечи вектора были соединены между собой через липкие концы (рис. 1, разд. 18.8). В этом случае выделять придется единственный фрагмент ДНК (состоящий из правого и левого плеч), который
Использование Я-векторов для конструирования библиотек ДНК
25
благодаря большому размеру легко отделяется от центрального фрагмента. Методику очистки ДНК плеч фага можно найти в работе [2].
Для EMBL3 существует и другой метод [6]. К участкам ВатШ этого вектора с внутренней стороны прилегают сайты froRI (см. рис. 4). При совместной обработке рестриктазами ВатШ и .EcoRI (двукратное расщепление) с обоих концов центрального фрагмента отщепляются короткие (<10 п. н.) фрагменты ВатШ-ЕсоЩ. В этом случае центральный фрагмент оказывается неспособным конкурировать с фрагментами донорной ДНК при лигировании с плечами вектора. Более того, если для осаждения векторной ДНК вместо этанола использовать изопропанол, короткие фрагменты остаются в растворе (см. разд. 18.8). Метод двойного расщепления, однако, применим не всегда, так как многие векторы не имеют расположенных нужным образом сайтов рестрикции. Кроме того,Гдаже если два фермента используются одновременно (в таком случае их требования к буферу и кофакторам должны быть совместимы), любая данная последовательность полилинкера будет расщепляться сначала одним из них. Второй фермент должен будет расщеплять участок, расположенный очень близко к концу молекулы ДНК^ (в вышеприведенном случае — ближе 10 п. н.). Ряд ферментов, например некоторые партии Sail, рестрицируют близкие к концу участки с низкой эффективностью. Для любой пары ферментов возможность использования этого метода необходимо проверять экспериментально (см., однако, работу
[10]). ДНК вектора EMBL3 следует сначала обработать ВатШ, затем довести ионную силу буфера до нужного для <?coRI значения и обработать трехкратным избытком этого фермента. При удалении центрального фрагмента важно проконтролировать число фаговых частиц, образующихся при лигировании векторной ДНК на себя. Не следует считать, что они полностью отсутствуют. Для некоторых целей может оказаться необходимым свести их число к абсолютному минимуму. Для EMBL3 и EMBL4 можно удалить (или инактивировать) центральный фрагмент и одновременно провести селекцию против родительского фага (разд. 14 и 15).
4. Рекомбинация и упаковка
В большинстве случаев инфекционные частицы получают при помощи упаковки рекомбинантных молекул ДНК in vitro, поскольку именно [фаговая инфекция является наиболее эффек^ тивным способом введения ДНК фага в бактериальные клетки.] Трансфекция — менее эффективный, но более простой метод — будет обсуждаться в разделе 4.3.
26
Глава 1
При упаковке in vitro можно получить более 108 инфекционных фаговых частиц фага на 1 мкг А,-ДНК. Такая эффективность позволяет получать более 106 рекомбинантных молекул на 1 мкг донорной ДНК. Упаковку in vitro производят при т> мощи «упаковочных экстрактов», для приготовления которых индуцируют клетки Е. coli, лизогенные по некоторым мутантам фага X. Экстракт содержит все структурные белки, необходимые для упаковки Л-ДНК в инфекционную фаговую частицу. Экстракты представляют собой коммерческие препараты, которые могут сохраняться при —70 °С. Методики их приготовления выходят за рамки этой главы. С ними читатель может ознакомиться в работах [1] и [2].
4.1. Реакция лигирования
Убедившись в пригодности препаратов рестрицированной векторной ДНК, достаточное количество которой составляет 20—50 мкг, необходимо определить оптимальные концентрации векторной и донорной ДНК в реакции лигирования. Как конкатенированные, так и в несколько меньшей степени линейные молекулы А-ДНК являются хорошими субстратами для упаковки in vitro, тогда как мономерные кольца не упаковываются. Условия лигирования, выбранные так, как описано в разд. 18.9, благоприятствуют образованию длинных конкатенированных молекул ДНК. Для этого требуется, чтобы плечи вектора были отожжены перед лигированием (рис. I) и чтобы реакция проводилась при относительно высокой концентрации ДНК (см. разд. 4.3).
Теоретически возможно [2] рассчитать a priori концентрацию участвующих в реакции молекул ДНК, оптимальную для образования нужного продукта лигирования. На практике, однако, часть молекул имеет нарушенные липкие концы или другие повреждения. Кроме того, хотя концентрацию векторной ДНК можно измерить довольно точно, количество донорной ДНК может быть определено лишь визуально по флуоресценции этиди-умбромида, а этот метод не очень точен. Учитывая эти сложности, часто оказывается удобным оптимальные концентрации находить эмпирически, используя теоретические значения в качестве отправной точки. Простейший подход состоит в независимом анализе каждой из переменных в серии пробных реакций, как это описано в разд. 18.9.
