Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Использование Я-векторов для конструирования библиотек ДНК
29
Таблица 1. Число (N) независимых рекомбинантных молекул ДНК, которые должны быть включены в фаговый вектор замещения или в космиду для того, чтобы с вероятностью 99% клонировать уникальную последовательность ДНК
Организм Приблизи N для встав N для встав
тельное со ки длиной ки длиной
держание 20 т. п. н.1) 45 т. п. н.1)
ДНК в гап
лоидном ге
номе, п. н.
Escherichia coli
(бактерия) 4,2-106 9,2-102 4,3-102
Saccharomyces cerevisiae
(дрожжи) 1,4-10» 3,2-103 1,4-103
Drosophila melanogaster
(плодовая мушка) 1,4-10® 3,2-104 1,4-104
Strongylocentrotus purpuratus
(морской еж) 8,6-108 2,0-105 8,8-104
Homo sapiens
(человек) 3,3-109 7,6-105 3,4-105
Triticum aestivum
(гексаплоидная пшеница) 1,7-1010 3,9-10s 1,7- 10е
’) Расчеты выполнены в предположении, что расщепление донорной ДНК случайно, что не вполне строго выполняется прн неполном гидролизе SauSA или МЬоI. Цифры,, однако, достаточно точны для большинства случаев.
Если «х» — размер вставки, а «у» — размер гаплоидного ге-
нома (в одних и тех же единицах), то библиотека из
in (1 — х/у)
клонов будет с вероятностью «р» содержать любую выбранную-
последовательность ДНК [12]. Полагая, что размер вставки, равен 20 т.п.н. и выбрав р = 0,99, получим цифры, приведенные в табл. 1. Для сравнения приведен размер библиотеки, необходимый при клонировании вставок длиной 45 т. п. н. в космидном* векторе. Следует отметить, что для клонирования гетерозиготных последовательностей негаплоидных организмов требуются
большие библиотеки.
7. Работа с ограниченным количеством донорной ДНК
Описанные выше процедуры удобно проводить с относитель-
но большими количествами исходного материала (>100 мкг
высокомолекулярной ДНК). 5—10 мкг понадобятся для определения оптимальных условий частичного расщепления рестрик-тазой. Значительная часть частично расщепленного материала-не попадает в желаемый диапазон размеров. Потери могут про-
30
Глава 1
исходить и на других этапах, например при диализе и осаждении этанолом фракций солевого градиента. Более того, некоторые партии рестриктаз могут (и не так уж редко) характеризоваться побочными нуклеазными активностями, которые еще более снижают выход рекомбинантной ДНК. Наконец, свойства препаратов векторной ДНК и упаковочных экстрактов могут значительно меняться от партии к партии. Если количество исходного материала не лимитирует исследователя, на некоторые из этих потенциальных трудностей можно не обращать внимания.
Существует возможность конструировать библиотеки, имея много меньшие количества ДНК, выделенной, например, из такого невозобновляемого источника, как небольшая опухоль. Считая, что все этапы клонирования проходят с максимальной эффективностью и без потерь, для библиотеки из более чем 106 рекомбинантов достаточно 1 мкг фракционированной по размеру ДНК Гб]. Такая эффективность, к сожалению, может быть достигнута очень редко.
Как уже отмечалось, выделение геномной ДНК следует проводить с максимальной тщательностью. Метод, описанный •в разд. 18.4, можно использовать для выделения всего 10— 20 мкг пригодной для клонирования ДНК. Поскольку использовать эту ДНК для определения условий частичного расщепления было бы расточительно, условия эти подбирают, манипулируя с другой, более доступной ДНК, выделенной тем же способом. Затем при выбранных условиях расщепляют часть интересующей нас ДНК и аликвоту (~ 0,5 мкг) анализируют в 0,3%-ном агарозном геле. При необходимости условия изменяют и расщепляют остаток препарата, намеренно ошибаясь в безопасную сторону. Реакцию останавливают быстрым замораживанием (а не ЭДТА или фенолом), чтобы при необходимости можно было внести дополнительное количество фермента.
Максимальной эффективности можно добиться, обрабатывая фрагменты ДНК фосфатазой, используя их непосредственно для лигирования с подходящей векторной ДНК (разд. 3.2) и проводя упаковку в условиях, благоприятствующих включению в состав рекомбинантных молекул как больших, так и малых фрагментов-вставок. Если фрагменты все же необходимо фракционировать в сахарозном или солевом градиентах, следует использовать небольшие центрифужные пробирки (например, типа Beckman SW51) и соблюдать осторожность при осаждении этанолом (разд. 18.2). Если материала слишком мало для анализа -фракций при помощи электрофореза, отберите их по эффективности включения в фаговые частицы.
