Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Гловер Д. -> "Клонирование ДНК. Методы" -> 6

Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.

Гловер Д. Клонирование ДНК. Методы — М.: Мир, 1988. — 538 c.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка): klonirovadnkdnkmetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 2 3 4 5 < 6 > 7 8 9 10 11 12 .. 253 >> Следующая

Чаще всего используют рестриктазы Sau3A и Mbol вследствие их совместимости с BamHI (разд. 3.3). Оба фермента узнают тетрануклеотидную последовательность (GATC), которая повторяется в среднем через каждые 44 (256) пар оснований в случайной последовательности ДНК. Таким образом, для получения фрагментов длиной 20 т. п. н. необходимо расщепить-лишь 1/80 доступных участков. Однако эта цифра зависит от GC-состава используемой донорной ДНК, поэтому оптимальную концентрацию фермента определяют эмпирически при помощи пробных реакций (рис. 2, разд. 18.5).
При оптимальных условиях максимум распределения фрагментов по размеру должен попасть в нужную область (18— 22 т. п. н. для описываемых здесь векторов). Тем не менее в таком препарате будет содержаться и небольшое количество коротких фрагментов. Если эти фрагменты не удалить, они могут включиться в вектор и присутствовать в нем в виде множественных вставок. Длинные фрагменты, с другой стороны, могут оказаться слишком большими для упаковки. Кроме того, рекомбинантные молекулы ДНК, близкие по размеру к верхнему и нижнему пределам упаковки, могут подвергаться Rec-за-висимым делециям и дупликациям или Иес-независимым деле-циям и перестройкам (разд. 16.2). фрагменты нужного размера можно отделить от остальных при помощи центрифугирования в градиентах плотности хлористого натрия или сахарозы (разд. 18.6) либо электрофорезом в агарозном геле [7]. Первый метод позволяет получить ДНК, более пригодную для лигирования, так как агарозу и другие примеси, ингибирующие лигазу, иногда трудно удалить из препаратов ДНК, выделенной из геля. Диапазон длин фрагментов, присутствующих в каждой из фрак-
2*
20
Глава 1
л Ь
4 (НЗ)
-----23,#
9,5
6.7
4,3
2,3
2,0
Рис. 2. Частичное расщепление высокомолекулярной ДНК SauSA. Серия пробных реакций проводилась так, как описано в разделе 18.5. ДНК рестрицирова-ли, используя концентрации фермента, близкие к оптимальной, затем разделяли электрофорезом в 0,3%-ной агарозе при 20 В в течение ночи. На рисунке приведена фотография геля после окраски этидиумбромидом. Маркерами служили интактная ДНК фага X и а-ДНК, рестрицированная Hind.III. Образцы Я-ДНК перед нанесением прогревали в течение 10 мин при 68 °С для диссоциации их липких концов. В препаративной реакции рестрицировали 200 мкг высокомолекулярной ДНК: половину объема в условиях, соответствующих дорожке 2, а половину — в условиях, соответствующих дорожке 3. Отметим, что некоторая часть ДНК относительно устойчива к расщеплению Sau3A. Эта ДНК, мигрирующая, как видно на рисунке, позади интактной ДНК фага X, не может быть клонирована ни с помощью фага Я, ни с помощью космидных векторов.
дий солевого или сахарозного градиентов, определяют при помощи^ электрофореза в 0,3%-ном агарозном геле (рис. 3), и фракции, содержащие фрагменты нужного размера, собирают для дальнейшей проверки. Количество ДНК в каждой из фракций оценивают визуально по флуоресценции интеркалирующего красителя— этидиумбромида (разд. 18.6). ДНК, присутствующую во фракциях градиента, перед клонированием необходимо сконцентрировать; обычно это делают при помощи осаждения этанолом. При осаждении малых количеств ДНК этанолом (разд. 18.2) могут происходить неконтролируемые потери, поэтому количество ДНК во фракциях следует определять после их концентри-
Использование Я-векторов для конструирования библиотек ДНК
21
Высокая соль Низкая соль
23,7 —
3,5 — 6,7 — 4,3 —
Рис. 3. Электрофоретический анализ донорной ДНК, частично расщепленной SauSA и фракционированной в градиенте концентрации соли. Частично рестри-цированную ДНК фракционировали, как описано в разделах 3.2 и 18.6; аликвоты анализировали в 0,3% -ном агарозном геле, как указано в подписи
к рис. 2.
рования. Альтернативный метод заключается в обработке частично расщепленной ДНК фосфатазой (см. замечания при проверке препаратов фосфатазы в разд. 18.3) и последующем лигировании с расщепленным вектором. Лигаза не способна соединить две молекулы ДНК, если обе они лишены 5'-конце-вых фосфатных групп. Таким образом, обработанные фосфатазой фрагменты донорной ДНК не могут образовывать множественные вставки.1 Останется еще некоторая часть рекомбинантных молекул ДНК, слишком длинных либо слишком коротких для упаковки, и отбор нужных по длине фрагментов выпадает на долю экстракта для упаковки in vitro (разд. 4.2). Размер фрагмента, способного к упаковке, может варьировать в значительных пределах (описанные здесь векторы пригодны для клонирования фрагментов от 9 до 22 т. п. н.), вот почему сконструированные таким способом библиотеки будут содержать больше рекомбинантов, чем необходимо для представления полного генома, в особенности если используются упаковочные экстракты, не накладывающие сильных ограничений на малые рекомбинантные молекулы. Следует отметить, что этот метод приводит к появлению рекомбинантных геномов, близких по размеру к верхнему и нижнему пределам упаковки и вследствие этого потенциально нестабильных. Появления таких геномов (по крайней мере близких к нижнему пределу упаковки) можно избежать, подобрав подходящие упаковочные экстракты и буферы (разд. 4.2).
Предыдущая << 1 .. 2 3 4 5 < 6 > 7 8 9 10 11 12 .. 253 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed