Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Для окрашивания и фиксации электрофореграмм гели или другую поддерживающую среду обычно погружают в соответствующий раствор. Если нужно обработать одновременно несколько гелей, то их помещают либо в отдельные сосуды, например в пробирки (в опытах со столбиками полиакриламидного геля), либо в общую ванну, которая должна иметь отдельные отсеки для гелей, сообщающиеся между собой для обеспечения хорошего перемешивания раствора.
Диффузия красителя в поддерживающую среду является той стадией, которая в конечном счете лимитирует скорость всего процесса окрашивания* Следовательно, длительность этой процедуры в каждом конкретном случае зависит от свойств и геометрической формы поддерживающей среды, а также от концентрации и температуры окрашивающего реактива. Поэтому во многих прописях рекомендуют сравнительно высокие концентрации красящих веществ, если они не вызывают сильного окрашивания фона. Как правило, растворы красителей используют многократно и обновляют лишь тогда, когда становятся заметными какие-либо признаки нарушения окрашивания или фиксации. Постепенно в результате связывания красителя с макромолекулами его концентрация в растворе снижается. Кроме того, разведение раствора красителя происходит вследствие
выделения воды из поддерживающей среды, особенно из гелей. Нельзя забывать и о том, что при инкубации гелей с высоким содержанием ДСН или мочевины эти вещества экстрагируются из них и переходят в окрашивающий раствор. В дальнейшем это может помешать фиксации белков.
Скорость диффузии зависит также и от температуры. Эта закономерность отражена во многих методиках, в которых путем повышения температуры добиваются сокращения времени фиксации и окрашивания белков. (Подробнее об этом см. в разд. II.5.1.)
Ускорения миграции красителя удается достигнуть и с помощью электрического поля. Швабе /[1151] предложил аппарат для быстрого электрофоретического окрашивания и обесцвечивания столбиков полиакриламидного геля, которые помещают на подложку, отделяющую катодный сосуд от анодного. Катодный сосуд заполняют 2%-ным раствором амидового черного 10 В в 5%-ной уксусной кислоте. Электрофорез длится 8 мин, что вполне достаточно для окрашивания гелей. Затем окрашивающий раствор заменяют разбавленной уксусной кислотой и продолжают электрофорез для удаления избытка красителя.
На том же принципе основана методика окрашивания полипептидов кишечной стенки после их разделения путем электрофореза в полиакриламидном геле с применением кислой буферной системы [10]. После нанесения пробы электрофорез проводили в течение 25 мин, затем в катодный сосуд добавляли
0,5%-ный (масса/объем) раствор амидового черного 10 В (0,25 мл на каждые 100 мл электродного буфера) и электрофорез продолжали еще 15 мин, после чего катодный раствор заменяли свежеприготовленной 0,01 М уксусной кислотой и вновь проводили электрофорез до тех пор, пока избыток красителя не переходил в анодный сосуд. Встречная миграция красителя приводила к еще большему сужению зон и получению более светлого фона по сравнению с тем, что наблюдается при окрашивании гелей амидовым черным 10 В обычным способом или кумасси ярким синим после фиксации белков ТХУ. Аналогичные приемы были использованы ![576, 788] для окрашивания гисто-нов после их разделения в кислой среде с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Описанная методика очень проста, занимает мало времени и позволяет визуализировать зоны, не вынимая гелей из стеклянных трубок. Встречная миграция красителя особенно удобна в тех случаях, когда по каким-либо причинам трудно осуществить фиксацию полученных зон, вследствие чего применение других способов окраски приводит к потере отдельных полос и ухудшает разрешение.
Помимо перечисленных достоинств описанная процедура имеет и очевидный недостаток, заключающийся в том, что фик-
сация наиболее быстрых фракций происходит тогда, когда более медленные фракции еще продолжают двигаться [Ю].
Если при окрашивании поддерживающую среду пропитывают раствором красителя, то после этого приходится проводить еще одну операцию — удаление избытка красителя (обесцвечивание).
Простейший способ обсцвечивания фона состоит в вымачивании поддерживающей среды в жидкости, в которой свободный краситель хорошо растворяется, а его комплексы с макромолекулами не диссоциируют. Такой растворитель (часто смесь растворителей) либо идентичен растворителю, использованному для получения окрашивающего реактива, либо имеет другой состав. Процесс обесцвечивания гелей путем их вымачивания занимает много времени. Один из способов его ускорения — это частая смена растворителя, который можно использовать многократно, если удалять из него экстрагированный краситель, например, посредством адсорбции на активированном угле. Нетрудно изготовить специальное устройство для непрерывной замены и очистки обесцвечивающего раствора. С этой целью к сосуду с обесцвечивающим раствором присоединяют насос, который прокачивает его через слой активированного угля и вновь возвращает в ванну с отмываемыми гелями |[ 198]. Еще более простой, хотя и менее эффективный способ непрерывной очистки обесцвечивающего раствора заключается в том, что в него помещают диализный мешок, наполненный активированным углем. Перемешивание раствора также помогает увеличить скорость обесцвечивания. Если такая «автоматическая» система применяется для обработки столбиков полиакриламидного геля, то их целесообразно сначала вложить в перфорированные пробирки, прежде чем погружать в обесцвечивающий раствор.
