Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
за. Например, электрофорез на бумаге обычно проводят при постоянном напряжении, а диск-электрофорез в полиакриламидном геле — при постоянном токе. Очень простой руководящий принцип, хотя и не всегда верный, заключается в том, что в случае неоднородной буферной системы более высокого разрешения можно достигнуть при стабилизации тока. Вместе с тем если электрическое сопротивление в разделительной камере существенно возрастает во время опыта (как, скажем, при ИЭФ), то лучше прибегнуть к стабилизации напряжения.
При всех видах электрофоретических процедур очень важно избегать повышения температуры в системе или по крайней мере в ее определенной части. Это объясняется не только тем,, что большинство биологических макромолекул термолабильны,, по и тем, что местный перегрев вызывает изменение сопротивления, а следовательно, и однородности электрического поляг что неизбежно приводит к получению невоспроизводимых ре-зультатов.
Чем выше приложенное напряжение, тем больше подвиж-ность заряженных компонентов и тем меньше требуется времени для достижения удовлетворительного разделения. Максимально возможное напряжение ограничено выделением джоу-лева тепла. Неблагоприятные воздействия образовавшегося тепла, неизбежно возникающие при всех видах электрофореза, можно существенно уменьшить путем правильного подбора соответствующей буферной системы и конструкции используемого аппарата, тщательным охлаждением и применением оптимальных величин напряжения или тока.
Поскольку количество выделяющегося тепла пропорционально квадрату силы электрического тока, Аллен и др. [21] предложили стабилизировать при электрофорезе электриче-
скую мощность (см. также [305]). Источник питания такого типа выпускается фирмой Ortec (США). Он дает на выходе либо импульсное напряжение со стабилизацией по мощности, либо напряжение постоянного тока со стабилизацией по напряжению. Форма импульса такова: сначала резкое нарастание, а затем экспоненциальный спад. Импульсное напряжение характеризуется низким коэффициентом заполнения импульса, т. е. интервал между импульсами намного больше длительности самого импульса. И хотя средний уровень мощности у этого источника примерно такой же, как и у источников постоянного тока, пиковое напряжение в импульсе оказывается во много раз выше; поэтому удается получить более четкое разделение 0ез избыточного выделения тепла.
1.15. Обнаружение,
количественное определение и характеристика макромолекул после электрофореза
1.15.1. Выявление макромолекул по поглощению ультрафиолетового света и флуоресценции
Окрашивание белков обычно приводит к их денатурации и не позволяет получать точные количественные данные. В связи с этим были предприняты попытки выявлять белки и нуклеиновые кислоты по поглощению ими ультрафиолетового света. К тому же методы обнаружения нуклеиновых кислот в ультрафиолетовом свете, а белков по флуоресценции, как правило, более чувствительны, чем методы, основанные на связывании макромолекул с красителями.
Агаровый и агарозный гели обнаруживают эффект рассеивания Тиндаля, который серьезно осложняет измерения при длинах волн ниже 300 нм. В то же время высушенные пленки этих гелей не обладают каким-либо особым поглощением между 250 и 1000 нм, поэтому белки и нуклеиновые кислоты рекомендуется анализировать в высушенных гелях [1419].
Благодаря наличию в молекуле акриламида амидного хромофора с ненасыщенными связями пик поглощения этого соединения в УФ-свете находится при длине волны 280 нм (ОП280-5). После полимеризации акриламида поглощение при 280 нм снижается до 0,3 [1377]. Согласно Лёнингу [777], при длинах волн до 270 нм величина экстинкции полиакриламидного геля составляет меньше 0,3, однако при дальнейшем снижении длин волн эта величина резко возрастает и при 230 нм достигает 0,565 [315]. В случае проведения измерений в ультрафиолетовой части спектра незаполимеризовавшийся акриламид следует удалить из геля с помощью преэлектрофореза. Для получения совершенно прозрачного геля необходимо, чтобы концентрация бис-акриламида была как можно более низкой, желательно [1377] менее 0,2% при использовании 7,5%-ного геля. Оптические артефакты могут возникать из-за царапин, частичек пыли или сморщивания геля.
В агаровом геле нуклеиновые кислоты сохраняют свои спектральные свойства [1303]. Они характеризуются высоким молярным коэффициентом экстинкции, который почти не зависит от их нуклеотидного состава. Следовательно, их можно количественно и с высокой чувствительностью определять при
'+При 5U6 нм после
у^При 5U6 нм после трашивония амидовым черным ЮВ
j nfJU /.OVnir,
без окрашивания
? При 280 нм
О
1 2 3 4 5
Концентрация альбумина в пробах, г%
Рис. 70. Суммарные величины поглощения света альбумином сыворотки крови человека до и после окрашивания в зависимости от количества альбумина [1419]. Пробы альбумина во всех случаях имели один и тот же объем. Измерения проводили на пленке высушенного агарового геля.
