Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
вующих в настоящее время источников питания. Следует избегать и чрезмерно высоких концентраций, приводящих к затруднениям, овязатаньгм с отводом выделяющегося тепла.
ИЗУЧЕНИЕ БЕЛКОВ МЕТОДОМ ИЗОТАХОФОРЕЗА
Подвижность белков в свободном растворе примерно на порядок ниже, чем подвижность небольших молекул. Например, для белков сыворотки крови при pH 8,6 и 25 °С она составляет 1,2*10-5—7,6*10-5 см2/(В*с) [1116]. Поэтому изотахофорез
макромолекул можно проводить в более коротких трубках, но вместе с тем при этом необходимо использовать какую-либо ан-тиконвекционную среду (обычно крупнопористый полиакриламидный гель). В процессе изотахофореза белки могут достигать очень высоких концентраций, часто 5—10%. Это означает, что они собираются в очень узкие зоны, тесно прилегающие одна к другой, и поэтому их не удается различить даже с по-
мощью весьма чувствительных УФ-детекторов [52]. Для того чтобы разделить белковые зоны, Овендсен и Роуз [1258] применили амфолиты-носители, образующие линейный градиент подвижности (рис. 66), так как они гетерогенны по значениям pL Отсюда (вытекает, что среди этих амфоли-тов-но'сителей всегда есть такие, подвижность которых окажется промежуточной между подвижностями исследуемых белшв (рис. 67).
В ряде работ [233, 478,
U79, 1116] были подробно изучены параметры изотахофореза белков и показано, что амфолиты-носители способны выполнять роль пространственных разобщителей (спей-серов). Отрицательная сторона их применения заключается в том, что часть молекул амфолитов-носителей может обладать такими же подвижностями, как и отдельные исследуемые белки, что приведет к расшире-
Рис. 66. Линейный градиент подвижности, образованный 1,0 мкл 12%-ного (масса/объем) раствора амфолитов-носителей с диапазоном pi 4—6 [1116]. Определяли УФ-поглощение и температуру.
Рис. 67, Результаты изотахофореза 0,2 мкл 10%-ного (масса/объем) раствора церулоплазмина, выявленные при измерении УФ-поглощения [1116]. А. Без добавления амфолитов-носителей. Б. С добавлением 0,4% (масса/объем) амфолитов-носителей.
нию белковых зон. Впрочем, иногда такое действие а'мфолитов оказывается полезным, так как некоторые белки при слишком высокой концентрации склонны выпадать в осадок. Применяют также и другие спенсеры, такие, как аминокислоты [1350] или слабые кислоты. Однако требуется провести еще очень большую работу, чтобы найти эффективные спейсеры, отвечающие предъявляемым к ним требованиям.
Для изотахофореза белков желательно использовать узкие трубки и проводить его в полиакриламидных гелях, не проявляющих по отношению к исследуемым веществам свойства молекулярного сита. Изотахофорез обладает почти таким же хорошим разрешением, как и диск-электрофорез или изоэлектрическое фокусирование. Изо-тахофореграммы белковых смесей очень похожи на картины изоэлектрофокусирования [1116], так как компоненты таких смесей в кислотной системе разделяются главным образом в результате различий в значениях их ИЭТ [501]. Преимущество же изотахофореза заключается в том, что в отличие от изо-
-IgG/lgA
.7
-2
-3
-4
Рис. 68. Разделение в полиакриламидном геле .10 мкл свежей сыворотки крови человека с использованием в качестве пространственных разобщителей 10 мкл 40%-ного (масса/ /объем) раствора амфолитов-носителей с pi 5—6 [1116]. Миграция в направлении сверху вниз. 1 — трансферрин; 2 — гал-тоглобин; 3—альбумин+церу-лоплазмин; 4 — преальбумин+ +а|-антитрипсин; 5 — орозо-м у ко ид.
электрического фокусирования он не приводит к осаждению белков [233].
Изотахофорез был с успехом применен для получения гемоглобина человека [1256], продуктов распада фибриногена г238], а также при изучении белков сыворотки крови (рис. 68) 207, 233, 408, 1116] и спинномозговой жидкости человека 683].
ПРЕПАРАТИВНЫЙ ИЗОТАХОФОРЕЗ
Изотахофорез занимает особое место среди методов очистки 'веществ, так как его разрешающая способность возрастает с увеличением нагрузки. Поскольку концентрации разделяемых веществ задаются концентрацией ведущего иона, увеличение нагрузки приводит к удлинению зон. Дэвис и Розенбаум [280]
Рис. 69. Препаративное изотахофоретическое разделение белков сыворотки крови человека [280]. Л. 1 мл сыворотки; компоненты идентифицированы с помощью иммунопреципитации. 1 — преальбумин; 2 — орозомукоид; 3 — сп-ан-титрипсин; 4 — альбумин; 5 — церулоплазмин; 6 — гаптоглобин; 7 — трансфер-рин; 8 — аг-макроглобулин; 9 — иммуноглобулин A (IgA); 10 — иммуноглобулин М (IgM); 11 — иммуноглобулин G (IgG). Б. 2 мл сыворотки; 1 мл 40%-ного амфолина (pH 5—7) был использован в качестве пространственного разобщителя. Регистрация поглощения УФ-света при 280 нм. Начальное напряжение 800 В со стабилизацией силы тока в 10 мА, температура 10 °С, скорость элюции 25 мл/ч.
фракционировали с помощью препаративного изотахофореза белки, содержащиеся в 1 и 2 мл сыворотки крови человека, а затем анализировали полученные фракции методом им-муно-электрофореза (рис. 69). Описано также применение изотахофореза [624] для выделения миеломного белка IgD человека. В другой работе [408] сывороточные белки были разделены в препаративных количествах на большое число компонентов в полиакриламидном геле, содержащем 5% Т и 3% С. Для приготовления геля применяли фототголимеризацию в присутствии
