Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
260 нм. Описаны конструкции денситометров для сканирования нуклеиновых кислот в агаровом {1307] и полиакриламидном [777] гелях. В 2,2—2,6%-ном полиакриламидном геле удается выявить 0,05 мкг РНК в зоне шириной 1 мм [778].
Для белков коэффициент экстинкции при 280 нм намного ниже, чем соответствующая величина для нуклеиновых кислот при 260 нм, и зависит от содержания в белках тирозина и триптофана. Поэтому определение белков в УФ-свете по поглощению при 280 нм представляет собой менее чувствительную процедуру, чем методы окрашивания (рис. 70). К тому же для количественной оценки получаемых данных необходимо учитывать, что разные белки имеют неодинаковые коэффициенты экстинкции. Без построения специальных калибровочных кривых денситометрия в УФ-свете не позволяет производить прямое количественное сравнение кривых различных белковых зон. С помощью отдельных денситометров можно выявлять до
1 мкг 'белка [315].
При 230 нм белки поглощают УФ-свет значительно сильнее, чем при 280 нм. Измерение поглощения при 230 нм, обусловленное наличием в белках пептидных связей, позволило бы получать более точные количественные данные, если бы такому сканированию не мешало собственное поглощение полиакриламидного геля.
Для сканирования как окрашенных, так и неокрашенных полиакриламидных гелей сконструированы и имеются в продаже специальные денситометры »[ 19, 511, 601, 998, 1389].
Фотографирование в УФ-свете. Вещества, поглощающие УФ-свет, можно визуализировать, фотографируя их в этом
свете. Цанев и Стоянов [1307] накладывали высушенную пленку агарового геля на фильтровальную бумагу, пропитанную
0,1%-ным водным раствором эозина. После того как бумага подсыхала, пленку облучали УФ-светом, в котором эозин флуоресцирует. Нуклеиновые кислоты, поглощающие УФ-излучение, выявлялись в виде темных полос.
Лйзингер ![336] получал полиакриламидный гель, заливая гелеобразующий раствор в пространство между двумя пластинками, одна из которых была сделана из кварцевого, а другая — из флуоресцирующего уранового стекла (фильтр фирмы Corning типа 3750). При освещении кварцевой пластинки УФ-светом УФ-поглощающие соединения были видны как темные полосы на флуоресцирующем фоне.
Описано [523] также применение пластинок для тонкослойной хроматографии, покрытых слоем целлюлозы или силикагеля с добавкой флуоресцентного индикатора. Для защиты геля от высыхания и предотвращения прилипания к пластинке его накрывают прозрачным, не задерживающим УФ-света оберточным материалом (handi-wrap). Освещение пластинки коротковолновой УФ-лампой позволяет увидеть очень четкие полосы, соответствующие положению УФ-поглощающих макромолекул.
Выявление белков с помощью флуориметрии. Полиакриламидный гель флуоресцирует при длинах волн возбуждающего света 280 или 340 нм. Близкие длины волн возбуждают флуоресценцию соответственно нативных белков (максимум испускания 340 нм) и белков, меченных дансилхлоридом или 8-анилино-1-нафталинсерной кислотой (АНС; спектр испускания при 460—520 нм). И хотя максимум спектра флуоресценции геля находится при 415 нм, т. е. довольно далеко от максимального испускания флуоресценции как нативных, так и меченых белков, его широкая полоса в значительной степени перекрывает спектры флуоресценции белков. Для приготовления нефлуоресцирующего геля необходимо добавить к смеси мономеров ди-тиотреитол или заменить ТЕМЭД сульфитом ,[463].
Истон и др. [329] определяли белки в полиакриламидном геле по их естественной флуоресценции. Для ее возбуждения использовали свет с длиной волны 280 нм, измерение же проводили при 340 нм. Метод основан на флуоресценции триптофана, интенсивность которой линейно зависит от его содержания в белках. При соответствующих условиях получаемый сигнал прямо пропорционален концентрации излучающего вещества. Таким путем можно выявить 1 — 10 мкг белка [614].
Для определения белков была использована АНС [913], которая в водном растворе флуоресцирует только в том случае, если связана с белками или адсорбирована на них. Электрофорез проводят в присутствии АНС, затем гели суспендиру-
ют в растворе сульфата аммония (насыщенном на 2/з) и измеряют флуоресценцию белков.
Белки становятся флуоресцирующими при их взаимодействии с дансилхлоридом '[1175] или другими флуоресцентными красителями [153]. В этом отношении особого внимания заслуживает флуорескамин, так как ни он сам, ни продукты его гидролиза не флуоресцируют. Флуоресценция возникает лишь при взаимодействии красителя с белками [340, 1053].
50—100 мкг белка растворяют в 100 мкл 0,011 М фосфатного буфера (pH 8,5), содержащего по 5% ДСН и сахарозы. Раствор выдерживают в течение 5 мин при 100 °С, чтобы обеспечить полное связывание ДСН с белком, и после охлаждения смешивают при встряхивании с 5 мкл раствора флуорескамина (1 мг/мл) в ацетоне. Процесс включения метки в белок можно непосредственно наблюдать в УФ-свете. Затем к смеси добавляют 5 мкл раствора (5 мг/мл) бромфенолового синего [340].
После проведения электрофореза гели облучают светом с длиной волны 390 нм и измеряют флуоресценцию при 475 нм. С помощью специального флуориметра удается определить до
