Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Изотахофорезом называется такой вид электрофореза, при котором все заряженные компоненты движутся в электрическом поле с одинаковыми (изо) скоростями (тахо) [501]. Принцип изотахофореза был открыт еще Кольраушем в 1897 г., однако как метод разделения он начал распространяться лишь в 70-х годах после того, как были детально исследованы его основы и преимущества [346, 501]. С тех пор он, по-видимому, приобретает все более возрастающее значение в химии и биохимии при разделении ионов как с низкой, так и с высокой молекулярной массой. Нужно отметить, что Орнштейн [942] и Дэвис [281] в разработанном ими диск-электрофорезе использовали изотахофорез ('названный ими steady-state stacking — устойчивое состояние уложенных стопкой полос) для концентрирования белков перед разделением их молекул по размерам и заряду с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (разд. 1.11.1).
ПРИНЦИП ИЗОТАХОФОРЕЗА
При «классическом» электрофорезе разделяемые ионы находятся в однородном электрофоретическом буфере и движутся в электрическом поле с разными скоростями. В условиях изотахофореза все ионы перемещаются с одной и той же скоростью, но располагаются друг за другом в соответствии с их подвижностями. Рассмотрим зоны, содержащие отрицательно заряженные ионы А~ и В~ с подвижностями тА_>Шв" и общим противоионом Р+ (рис. 62,Л). При наложении электрического поля ионы будут двигаться с одинаковой скоростью в последовательно расположенных зонах (рис. 62, Б). Если учесть наличие ионов Н+ и ОН“, а также все ионизированные формы соединений А, В и Р, то удельную проводимость в зоне 1 мож-
А
о
7
р+ р+ В~ А~
Время АКонц. i
Время
Б
Рас. 6-2. Схематическое изображение концентраций двух ионов, имеющих разные подвижности при изотахофорезе.
но описать следующим уравнением:
где — удельная проводимость в зоне 1 (Ом-1-см-1), с0Hl — концентрация ионов ОН~ в зоне 1 (г-ион*см-3), сАи —концентрация иона А в зоне 1 с зарядом i (г-ион-ом~3), mHl — подвижность иона Н+ в зоне 1 (см^В^-с-1), г — заряд, F — заряд одной молекулы (С*моль-1) и а— максимальные степени ионизации соответственно ионов А, В и Р.
Для зоны 2 можно написать
cOHmOH2+cHmH2 + ^ ‘%;тв2;+2 Vp2i • (2)
а
Л
Так как сила тока для обеих зон одна и та же:
Л = '»,
(3)
из закона Ома следует
(4)
и
/2 — , (5)
где 1\ и h — плотности тока, a G\ и G2— градиенты напряжения соответственно в зонах 1 и 2.
Из уравнений (3), (4) и (5) получаем
Ог ' ^
Подставим уравнения (1) и (2) в уравнение (6):
а л
COHj^OHj + fn^Hj + 2 ,CAiinlAii + 2 icpli"lpit
С2 __ 1=0 1=1 /7\
Э n *
Сощт-ощ + Ch2'Hh2 + 2 icB2i^B2i + 2 “*2*mp2i (=0 1=0
В соответствии с принципом изотахофореза скорости движения зон / и 2 одинаковы:
U^UZ9 (8)
где U — скорость движения зоны (см*с-1). Далее получаем
Ut =0,тА1, (9)
где mAl — истинная подвижность вещества А, определяемая
как
т
1 а
Al = -^-'^icMimAu, (10)
1 i= О
где cxAi — общая концентрация вещества А (моль*см_3). Подставим уравнение (10) в уравнение (9):
Gi “
^Ai схА ^САцтАи. 00
/=0
При объединении уравнений (8) и (11) получаем г “ г р
1=0 * 1=0
^%mAUCAU=^'%mB2fB2i. (12)
Подставим уравнение (12) в уравнение (7):
а
а
X
mB2iCB2i
|5 Я
CQHjs^OHj + сн2тн2 + 2 iCB2imB2, + 2 1Cp2imp2i
я
X
а
я
(13)
Уравнение (13) вывел Роутс [1116]. Оно представляет собой расширенную форму регулирующей функции Кольрауша. Согласно этому уравнению, концентрация вещества В в зоне 2 определяется концентрацией вещества А в зоне 1.
Помимо баланса электрического тока, подробно описанного выше, существуют еще три других важных принципа, которые необходимо иметь в виду.
Баланс масс. Концентрация противоионов в зоне должна оставаться постоянной после достижения состояния равновесия, т. е. необходимо, чтобы количества противоионов, входящих в зону и покидающих ее, были равны между собой.
