Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Разрешение, получаемое с помощью денситометра, зависит от нескольких факторов:
1. Величина поперечного сечения светового луча на электрофореграмме. Она должна быть достаточно мала, так как соблюдение этого условия позволяет денситометру в каждый момент времени «видеть» только одну полосу. Это означает, что для различения полос, расположенных близко друг к другу, следует использовать более узкий световой луч, чем в случае полос,
находящихся далеко одна от другой. Поэтому денситометры, рассчитанные на сканирование бумажных электрофореграмм, как правило, редко применимы для полиакриламидных гелей,
2. Чувствительность детектора, измеряющего интенсивность света. Она определяет минимально возможное поперечное сечение светового луча, освещающего электрофореграмму. До некоторой степени ее можно компенсировать повышением яркости источника света. Если чувствительность оптической системы не-достаточна, то отдельные полосы с низкой интенсивностью окраски не будут зарегистрированы на денситограмме.
3. Диапазон измеряемой оптической плотности. Эта величина особенно важна, когда на одной и той же электрофореграм-ме есть полосы с очень интенсивной и очень слабой окраской, что встречается достаточно часто. Решающее значение для получения количественных результатов имеет размер интервала с линейной зависимостью.
4. Скорость сканирования. Разрешающая способность ден-ситометра ограничена механической инерцией системы перемещения электрофореграммы и пера самописца. При использовании самописцев с механическим приводом пера снижение скорости сканирования зачастую позволяет повысить разрешение. Большинство денситометров дает возможность выбрать нужную скорость регистрации. Для преодоления проблем, связанных с инерцией механических перьев, во многих денситометрах применена система записи с помощью светового луча. Однако б этом случае процедура сканирования несколько осложняется необходимостью проявления фотопленки.
5. Качество сканируемой электрофореграммы. Чтобы получить достоверную денситограмму, необходимо иметь надлежащим образом окрашенную и обесцвеченную электрофореграмму. Очень важную роль играют четкость и контрастность полос, а также слабая и равномерная окраска фона, неоднородность которого приводит к появлению на денситограмме ложных пиков и уступов. Другим существенным требованием является параллельность полос друг другу и перпендикулярность их направлению сканирования. В идеальном случае края полос должны представлять собой прямые параллельные линии. Однако к получению такой электрофореграммы можно лишь стремиться. Нз самом деле полосы обычно изогнуты. В такой ситуации один из возможных способов сканирования заключается в следующем: с помощью узкой щели на электрофореграмме выбирают продольный участок, проходящий по всей длине электрофореграммы параллельно направлению миграции анализируемых веществ. При этом исходят из предположения, что интенсивность окраски полос и расстояния между ними в выбранном участке и на всей электрофореграмме одинаковы.
Механические повреждения поддерживающей среды, возникающие, например, при разрезании пластин крахмального геля или при извлечении из трубок столбиков полиакриламидного геля, вызывают сильное светорассеяние, проявляющееся в образовании на денситограмме ложных пиков. Столбики геля действуют как цилиндрические линзы. Поэтому их помещают в стеклянные пробирки с уксусной кислотой и сканируют с помощью хорошо сфокусированного и узкого светового луча. Другой способ состоит в том, что гели вставляют в ячейку, изготовленную из двух параллельных стеклянных пластинок, расстояние между которыми несколько меньше, чем диаметр геля. При этом столбики геля слегка сплющиваются и на них образуются плоские поверхности. Световой луч, используемый для сканирования, должен быть немного уже плоскости геля.
Чтобы повысить чувствительность сканирования, необходимо работать при правильно выбранной длине волны. Во многих денситометрах для этого служат светофильтры. Если имеют дело с видимым отраженным светом, то цвет светофильтра должен быть дополнительным по отношению к цвету окрашенных полос. Так, например, при сканировании электрофореграммы с синими полосами требуется желтый светофильтр. В денситометрах иных типов имеются монохроматоры, дающие возможность выбрать желаемую длину волны. Кроме того, существуют спектрофотометры, к которым можно присоединить дополнительное устройство для перемещения геля.
Некоторые денситометры позволяют регулировать отношение расстояний между полосами на электрофореграмме к расстояниям между пиками на денситограмме. Благодаря такому усовершенствованию можно добиться лучшего разрешения и более точного интегрирования площадей пиков.
Другой путь повышения чувствительности денситометра заключается в применении специальной оптической приставки, увеличивающей изображение образца и тем самым повышающей разрешение. Такое приспособление особенно полезно при сканировании полиакриламидных гелей.
Денситограммы представляют собой графики зависимости оптической плотности от расстояния. На этом основании предполагают, что площадь пика пропорциональна количеству вещества, находящегося в соответствующей зоне. На практике, однако, действует несколько факторов, вызывающих отклонения от пропорциональности, что затрудняет количественную оценку денситограммы. Прежде всего возникает сомнение в том, что между количеством связанного данной фракцией красителя и содержанием в ней исследуемого материала существует прямая связь. (См. также главы, посвященные описанию способов окрашивания различных веществ после их разделения тем или
