Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
5-1СН% рибофлавина. Авторы показали, что белки сыворотки крови разделялись лучше, если их подвергали предварительному фракционированию сульфатом аммония. После этого разрешающая способность изотахофореза возрастала.
СИСТЕМЫ ДЛЯ РАЗДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ СЫВОРОТКИ КРОВИ МЕТОДОМ ИЗОТАХОФОРЕЗА
Система 1 [207]. Ведущий электролит: 0,24 М буфер трис-фос-фат (pH 6,1). Замыкающий электролит: 0,14 М буфер (3-аланин — трис (‘pH 8). Состав геля: 3,7% Г, 3,33% С, 0,5 мг% рибофлавина, 0,03 М трис-фосфатный буфер (pH 6,1), 80 мкл ТЕМЭД на 100 мл смеси, 3,1 % сахарозы. Гели длиной 13 ом формируют посредством фотополимеризации. Белок растворяют в замыкающем буфере и добавляют к нему 40%-'Ный раствор амфолитов-носителей с ИЭТ 5—8 (35 мкл на каждые 10 мкл сыворотки). Изотахофорез проводят в течение 2 ч при постоянной силе тока ( 2 мА на 1 гель).
Система 2 [1116]. Ведущий электролит: 0,03 М ацетат — 0,011 М трис,(рН 4,5). Замыкающий электролит: ip-аланин, pH 9. Состав геля: 3,5% Т, 5% С, 0,5 мг% рибофлавина, 0,03 М ацетат — 0,011 М трис (pH 4,5). 10 М'кл сыворотки крови человека смешивают с равным объемом 40%-ного раствора амфолитов-носителей с ИЭТ 5—6 и эту смесь наносят поверх геля.
Система 3 [280]. Применяется для препаративного изотахо-фореза. 100 мл раствора акриламида [3,67% Т, 5% С, 0,012 М. трис— 0,013М какодилат (pH 7), 0,25 мг% рибофлавина, 10-мкл ТЕМЭД на 100 мл смеси] полимеризуют в стеклянной колонке длиной 30 ом (составная часть прибора «Унифор» фирмы LKB-Producter АВ). Полимеризация заканчивается после 3 ч облучения. Нижний электродный сосуд и резервуар для буфера заполняют ведущим электролитом (0,012 М трис — 0,01$ М какодилат, pH 7), а замыкающий (буфер (0,032 М трис — 0,188 М р-аланин, pH 8,95) наливают поверх геля и в верхний резервуар для буфера. Затем через капилляр, расположенный в верхней части прибора, на поверхность геля наносят слой амфолина (40%, ИЭТ 5—7) объемом 2 мл. Устанавливают -постоянный электрический ток (10 мА), причем катод должен быть в верхнем электродном сосуде. Через 5 ч после того, как весь амфолин войдет в гель, ток отключают и на поверхность геля через капилляр наносят пробу, состоящую из 2 мл сыворотки, смешанной с 2 мл замыкающего буфера. Затем вновь включают ток (10 мА) и начинают элюцию ведущим буфером.
Все виды электрофоретического разделения основаны на движении заряженных молекул или частиц в электрическом поле. Для создания соответствующей интенсивности поля необходимы подходящие источники постоянного тока. Чаще всего для этой цели применяют устройства, преобразующие переменный ток в постоянный, напряжение которого можно регулировать. Источник питания с помощью металлических проводов присоединяют к электродам, встроенным в прибор для электрофореза. Электроды, которые обычно изготавливают из благородных металлов, погружают в буфер, заполняющий электродные сосуды. Эти электродные растворы обеспечивают непрерывность электрического поля в цепи, состоящей из энергопитающего прибора, анода, исследуемой пробы, электрофоретической среды и катода. Принципы составления буферных систем и некоторые практические рекомендации можно найти в главах, посвященных различным методам электрофореза. Здесь же мы собираемся дать лишь несколько полезных советов, чтобы помочь читателю выбрать подходящий источник питания, не прибегая к физико-химическим соображениям, основанным на законах электрохимии, или к сложным техническим аспектам конструирования силовых установок. Необходимо отметить, что многие фирмы предлагают самые разнообразные источники питания, различающиеся по диапазонам напряжения и силы тока.
Сопротивление в электрофоретической ячейке колеблется в ходе опыта, что обусловлено несколькими причинами. Электрофорез всегда сопровождается электролизом, приводящим к образованию водородных ионов на аноде и гидроксильных на катоде. Поскольку проводимость этих ионов примерно на порядок выше проводимости других ионов, присутствующих в буфере, электролиз может вызвать снижение общего сопротивления электрофоретической цепи. С другой стороны, сопротивление ячейки в зависимости от используемой электрофоретической системы может также и возрастать в процессе разделения, например при ИЭФ. Так как интенсивность электрического поля, выражаемая в В/см, определяет ту силу, которая заставляет заряженные молекулы двигаться, для «получения воопро-
изводимых результатов очень важно как можно более эффективно стабилизировать электрические параметры в ходе опы-та. Зависимость между напряжением, током и сопротивлением задана законом Ома: если происходит изменение сопротивления, то напряжение или ток, или оба вместе должны тоже измениться.
На практике чаще всего работают либо при постоянном напряжении, либо при стабилизированном токе. В самом делег если напряжение остается неизменным и сопротивление в кювете падает, то ток должен возрастать. Если же сохраняется на одном уровне ток, то уменьшение сопротивления неизбежно приведет к снижению напряжения. Аналогичные простые выводы на основе закона Ома можно легко сделать в каждом конкретном случае. Решение вопроса о том, удастся ли полу-чить лучшие результаты при поддержании неизменным тока или напряжения, зависит от выбранного метода электрофоре-
