Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
иным эл ектр офорегичеоки м
методам.) Кроме того, линейная зависимость наблюдается лишь в том случае, если выполняется закон Бера, который, как хорошо известно, действует только в ограниченном диапазоне концентраций.
Разделенные фракции макромолекул связывают различные относительные количества красителя, цвет которого может варьировать в зависимости от того, к какому белку присоединился данный краситель.
Все эти явления затрудняют сравнение площадей ников даже на одной и той же денситограмме.
бруски и Нараян [721] при количественном изучении яичного альбумина методом электрофореза в полиакриламидном геле показали, что площадь пика сильно зависела от концентрации геля и пройденного белком расстояния. Аналогичные наблюдения были сделаны Дэвисом и др. [283], как показано на рис. 71. Эти и другие упомянутые выше факторы указывают, что, прежде чем делать те или иные заключения, связанные с количественной оценкой электрофореграммы, необходимо установить зависимость между количеством нанесенного вещества и площадью соответствующего пика в каждой конкретной системе, используемой для электрофоретического разделения. Без такой проверки можно проводить лишь приблизительные определения.
Методически проведение измерений с помощью современных денситометров не представляет трудности. В большинстве случаев эти приборы снабжены интеграторами, позволяющими сразу получать величину площади каждого пика. При отсутствии интегратора это легко сделать с помощью одного из приемов планиметрии.
Некоторые авторы предпочитают сначала сфотографировать электрофореграмму, а затем полученный негатив проанализировать в обычном денситометре или чувствительном микроден-
Рис. 71. Получение калибровочных кривых для окрашенных белков в полиакриламидных гелях [283]. Гели, содержавшие разные количества сс-хи-мотрипсиногена, подвергали электрофорезу в течение различных промежутков времени, а затем сканировали. Полученные кривые интегрировали и площади пиков наносили на график против количества (мкг) белка в геле.
ситометре. Однако этот способ связан еще с одной операцией, которую необходимо выполнять с особой тщательностью, чтобы избежать дополнительных ошибок. В то же время он имеет и некоторые преимущества перед непосредственным сканированием электрофореграммы, так как использование тонкого и плоского негатива устраняет многие проблемы, обсуждавшиеся в связи со сканированием гелей.
Вейдекамм и др. [1389] описали быстрый и исключительно чувствительный метод анализа негативов, полученных при фотографировании полиакриламидных гелей, в которых разделенные компоненты выявлялись по их флуоресценции или путем окрашивания. Авторы воспользовались проекционной опознавательной системой PIQVANT, представляющей собой управляемое ЭВМ сканирующее устройство с подвижным лучом. Негатив проектируется на растр со следящей системой таким образом, чтобы продольная ось геля располагалась строго вертикально. Площадь, выбранная для измерений, автоматически сканируется в горизонтальном и вертикальном направлениях с помощью растровой системы. Растровое расстояние равно
36,5 мкм, но ЭВМ учитывает площадь круга с радиусом около 8 мкм вокруг каждой растровой точки. Ее яркость оценивается по линейной серой шкале с 64 уровнями яркости. Изображение геля на негативе разбивается по длине на 700—900 строчек. В каждой поперечной строчке измеряется примерно 80—100 точек. Такая система способна различать полосы, расстояние между которыми составляет всего 21 мкм. Анализ одного негатива занимает примерно 1 с. Результаты выдаются в обычной форме, т. е. в виде графика зависимости оптической плотности от расстояния между данной точкой и стартовой линией.
1.15.4. Фотографирование электрофореграмм
Фотографии электрофореграмм очень часто используют для хранения полученной при аналитическом электрофорезе информации, а также для наглядной демонстрации экспериментальных данных при их публикации. Кроме того, фотографии можно применять для денситометрирования, а в отдельных случаях и для количественной обработки электрофореграмм.
Хранение бумажных электрофореграмм и полосок ацетата целлюлозы после их соответствующего окрашивания, обесцвечивания и фиксации не представляет трудностей. Пластины агарового геля после высушивания превращаются в тонкие пленки и тоже хорошо хранятся. Сохранение же пластин крахмальных и полиакриламидных гелей более обременительно.. Лучше всего их держать в закрытых сосудах под слоем жидкости, обычно разбавленной уксусной кислоты. Но такие контей-
неры занимают много места, а окрашенные полосы с течением времени иногда выцветают. Скорость этого процесса зависит от природы красителя, методик окрашивания и обесцвечивания и, как правило, снижается на холоду и в темноте. Чтобы разрешить проблемы, связанные с хранением гелей, после их обесцвечивания рекомендуется воспользоваться одним из способов документирования полученных результатов.
Для фотографирования электрофореграмм пригодны практически все современные фотоаппараты с высококонтрастными фотопленками. Особенно удобны камеры фирмы Polaroid, дающие готовое изображение примерно через 1 мин. Можно использовать пленки любых размеров (24X36, 60X60 или 60X90мм). Очень важно иметь подставку для крепления осветительных ламп, штатива для гелей и фотокамеры. При наличии такой поддерживающей системы время экспозиции можно варьировать в широких пределах, что позволяет выбрать пленку с высокой контрастностью, так как в этом случае чувствительность играет менее важную роль. Обычно хорошие контрастные негативы, пригодные для увеличения и печати, удается получить на панхроматических пленках с чувствительностью 35—50 единиц ASA (15—25 дин) при их проявлении в мелкозернистом или сверхмелкозернистом проявителе.
