Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
0,5 мкг белка '[1053].
Белки, меченные флуоресцентными маркерами, изучают обычно методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии ДСН, так как в этой системе подвижности меченых и немеченых белков практически одинаковы.
Выявление нуклеиновых кислот с помощью флуориметрии. В отличие от одноцепочечных двухцепочечные молекулы ДНК и РНК взаимодействуют с бромистым этидием [758]. Образующийся комплекс возбуждается под действием света с длиной волны 360 нм и излучает при этом свет с максимумом интенсивности при 580 нм [661]. Чувствительность определения составляет 50 нг для ДНК и 100 нг для РНК. Применение специфических нуклеаз позволяет различать ДНК и РНК. Бромистый этидий добавляют [645] к пробам до электрофореза в таком количестве, чтобы отношение бромистый этидий/фосфор ДНК составляло примерно 0,1. При этой концентрации он практически не влияет на подвижность нуклеиновых кислот. По окончании разделения гели можно сфотографировать, использовав подходящий источник света и оранжевый светофильтр {1176].
1.15.2. Выявление разделенных
при электрофорезе компонентов путем их окрашивания
Связывание макромолекул с окрашенными веществами — это, вероятно, наиболее часто применяемый метод их выявления после электрофореза в хорошо сохраняющих форму поддержи-
вающих средах, таких, как бумага, ацетат целлюлозы и гели, состоящие из крахмала, агара, агарозы или полиакриламида.
Необходимо, чтобы используемый краситель отвечал изложенным ниже требованиям.
При взаимодействии красителя с макромолекулами должны возникать прочные комплексы или ковалентные соединения, образующие окрашенные зоны, нерастворимые при данных экспериментальных условиях.
Краситель должен связываться лишь с одним специфическим классом макромолекул, что обеспечивает избирательность определения. Если же он способен образовывать комплексы с соединениями нескольких типов (например, с нуклеиновыми кислотами, белками, гликопротеидами и липидами), то такие комплексы должны окрашиваться в разные цвета. Подобная картина наблюдается при использовании универсального красителя «стэйнзол» (от англ. «stains all» — красит все) [267].
Очень важно, чтобы поддерживающая среда не связывала краситель и его легко можно было удалить отовсюду, кроме зон, содержащих исследуемые макромолекулы. В противном случае сильно окрашенный фон затруднит анализ электрофореграмм.
С точки зрения чувствительности метода выгодно, чтобы образуемый красителем комплекс обладал высоким коэффициентом экстинкции.
Помимо перечисленных основных свойств красящих веществ имеется еще много других желательных, но не строго обязательных для них качеств. Существенно, чтобы краситель хорошо растворялся в таком растворителе или в такой смеси растворителей, которая не оказывает вредного влияния ни на поддерживающую среду, ни на. выявляемые вещества. Удобно, если от избытка красителя можно быстро освободиться, а окрашенный комплекс, содержащий определяемые макромолекулы, стабилен на протяжении длительного времени.
Выбор красителя и способа окрашивания зависит от состава изучаемого препарата, природы поддерживающей среды и в ряде случаев от метода разделения. Например, при фракционировании белков с помощью электрофореза в геле в присутствии ДСН или амфолитов-носителей к окрашиванию белков предъявляют особые требования. Эти вопросы будут рассмотрены в соответствующих главах, относящихся к отдельным конкретным методикам.
Визуализация макромолекул путем их окрашивания в методическом отношении представляет собой очень простую процедуру. Поддерживающую среду погружают на определенное время в ванну с раствором красящего вещества, после чего его избыток, не связавшийся с разделенными зонами макромолекул, удаляют. Электрофореграммы высушивают или хранят в соответст-
вующем растворе, состав которого зависит главным образом от природы поддерживающей среды.
По окончании электрофореза рекомендуется как можно быстрее провести фиксацию разделенных веществ путем их осаждения или высушивания, так как диффузия молекул продолжается и после отключения электрического тока, что приводит к ухудшению картины разделения. Бумагу и пленки из ацетата целлюлозы обычно высушивают, в случае же крахмального и полиакриламидного геля применяют осаждение разделенных веществ. Следует заметить, что пластины агарового и агарозного гелей, а также тонкие слои полиакриламидного геля тоже можно высушивать, но это, как правило, занимает много времени и, следовательно, нецелесообразно.
Осаждение разделенных веществ проводят до их окрашивания или одновременно с ним путем погружения электрофоре-граммы в реактив для фиксации и окрашивания.
Целый ряд фирм выпускает в продажу большое число красителей, пригодных для выявления макромолекул самых разных типов. При этом, однако, необходимо помнить, что, как показывает практика, качество реактивов в отдельных партиях часто сильно колеблется. Поэтому в тех случаях, когда требуется количественная оценка исследуемых веществ, для каждой партии препарата красителя должна быть построена своя калибровочная кривая.
