Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Решающим фактором при фотодокументировании является бестеневое освещение снимаемых объектов.
Непрозрачные электрофореграммы, полученные на бумаге, ацетате целлюлозы или в крахмальном геле, фотографируют только в отраженном свете, а прозрачные гели (например, полиакриламидный гель или ацетат целлюлозы и крахмальный гель после специальной обработки) — как в отраженном, так и в проходящем свете. В продаже имеются осветительные приборы, специально сконструированные для съемки электрофореграмм, однако при их отсутствии всегда можно изготовить в лабораторной мастерской простые осветители.
Для фотографирования в отраженном свете с помощью устройства, изображенного на рис. 72,Л, необходимы по крайней мере две лампы. Можно использовать также обычную репродукционную установку.
Прозрачные электрофореграммы желательно снимать в проходящем свете. Одно из наиболее простых приспособлений для создания равномерного освещения показано на рис. 72,5. Четыре или большее число лампочек симметрично размещают в ящике, накрытом прозрачной крышкой. Сверху кладут друг на друга несколько кусков оконного стекла, заматированного с помощью песка. Последовательное рассеяние света на матовых поверхностях дает равномерное освещение, что можно проверить, сфотографировав источник света без гелей. Во избежание по-
__3
А
Рис. 72. Различные устройства для фотографирования электрофореграмм. А, Четырехламповый освежитель для фотографирования в отраженном свете. В. Простая система с лампой для фотографирования в проходящем свете; несколько кусков оконного стекла (4) с матовой поверхностью, полученной с помощью песка, обеспечивают равномерность освещения. В. Схематическое изображение метода темнопольного освещения. 1 — фотоаппарат; 2 — источник света; 3 — электрофореграмма; 5 — темный диск.
явления на негативе крупнозернистого фона электрофореграм-му помещают на пластинку оптически чистого прозрачного стекла или плексигласа, расположенную на несколько сантиметров выше верхнего матового стекла.
Наблюдение и съемку полос выпавшего в осадок белка (например, в случае иммуноэлектрофореза или изоэлектрического фокусирования с последующим осаждением ТХУ) лучше всего производить при освещении в темном поле. Для этого электро-фореграмму кладут на темную основу и освещают светом, падающим под определенным углом (рис. 72, В). Для освещения используют несколько ламп или кольцеобразный источник света.
Простой метод фотографирования прозрачных гелей представляет собой так называемая контактная печать. Гели, которые должны находиться в почти непосредственном контакте с фотобумагой, освещают рассеянным светом. После обработки фотобумаги проявителем полосы выявляются в виде расположенных на темном фоне белых или серых пятен того же размера, что и полосы в геле [51]. Вещества, сильно поглощающие ультрафиолетовый свет, удается выявлять этим способом без предварительного окрашивания.
Чтобы добиться хорошего разрешения на негативах фотокамеру рекомендуется устанавливать в непосредственной близости от электрофореграммы. Очень полезны для этой цели фотоаппараты, снабженные специальными удлинительными кольцами, вставляемыми между фотоаппаратом и его объективом. Контрастность изображения на негативе можно усилить с помощью подходящего фильтра, выбранного в соответствии с окраской полос на электрофореграмме.
Используя любую из описанных выше систем освещения, высушенные электрофореграммы можно фотографировать без всяких затруднений. Но при съемке влажных гелей нужно соблюдать специальные меры предосторожности, чтобы избежать их деформации вследствие усадки при высыхании. С этой точки зрения целесообразно помещать фотографируемые гели в жидкость, однако при этом не следует забывать, что волны на ее свободной поверхности или пузырьки газа в закрытом сосуде, а также оптическая неоднородность покрывающей гель пластины могут стать причиной возникновения различных помех. Во многих работах опубликованы фотографии столбиков полиакриламидного геля в пробирках, заполненных обесцвечивающим раствором. На таких снимках иногда появляются искаженные зоны, так как пробирки в этом случае играют роль цилиндрических линз. Столбики полиакриламидного геля можно сфотографировать и без раствора, положив их непосредственно на стеклянную пластинку. Как уже указывалось, такая процедура таит в себе опасность, связанную с изменением длины и формы геля. Подобные изменения особенно быстро происходят обычно тогда, когда гели обесцвечивают в смеси, содержащей органические растворители (метанол или этанол). Поэтому полезно перед фотографированием пропитать их уксусной кислотой, а съемку во избежание усадки производить как можно скорее. Чтобы сократить время пребывания геля на воздухе, целесообразно заранее подобрать все условия фотографирования, использовав для этого контрольный гель.
Если гели помещают прямо на стеклянную пластинку, очень важно удалить из-под них все пузырьки воздуха. Со столбиками геля возникает еще одна проблема: между стеклянной пластинкой и цилиндрической поверхностью геля часто образуется тонкая пленка жидкости, которая в свою очередь приводит к появлению линии, приблизительно параллельной оси столбика геля. Чтобы решить эту проблему, Паттерсон и Филлипс [979] создали простое приспособление для фотографирования столбиков полиакриламидного геля. Оно представляет собой ряд полукруглых лотков, вырезанных в плоской пластине из органического стекла. Поскольку гели, приготовленные в трубках с внутренним диаметром 5 мм, в процессе окрашивания и обесцвечивания
