Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
обычно набухают, так что их диаметр становится равным 6 мм, канавки делают шириной 8 мм и глубиной 3 мм. Чтобы добиться максимальной прозрачности, поверхность канавок смачивают. В таком приспособлении можно одновременно снимать несколько помещенных в канавки гелей.
Проблема другого рода, связанная с фотографированием полиакриламидных гелей после диск-электрофореза, заключается в том, что в этих гелях отдельные полосы расположены очень близко друг к другу. Вместе с тем известно [184], что на фотоснимке соседние полосы различаются только в том случае, если между ними имеется некоторое минимальное расстояние, которое не трудно рассчитать с помощью тригонометрических функций на основе схематического чертежа, приведенного на рис. 73. Если оптическая ось объектива фотоаппарата проходит через середину стол'бижа геля длиной 40 мм и диаметром 5 мм, а сам объектив отстоит от геля на 160 мм, то минимальное расстояние между соседними полосами на концах геля должно составлять не менее 0,625 мм. Зачастую оно оказывается меньше, и тогда две полосы выглядят на негативе как одна, потому что фотоаппарат не способен отличить верхний край одной полосы от нижнего края другой. Эту трудность можно преодолеть путем перемещения объектива в направлении продоль-
ной оси геля, как это делается в большинстве денситометров. Было предложено и другое решение этой проблемы [184]. Гели помещают в трубку, аккуратно изогнутую таким образом, что расстояния между объективом и каждой полосой в геле оказываются одинаковыми.
Оливер и Чокли [939] избрали иной путь, чтобы избавиться от такого источника ошибок. Они вложили столбики геля в наполненные 0,9 н. уксусной кислотой стеклянные пробирки с внутренним диаметром 0,6 см и расположили их горизонтально над источником рассеянного света. Затем между ними и объективом фотоаппарата поместили стеклянные пробирки с водой,
5мм -
160 мм
U0 мм
Рис. 73. Схема фотографирования гелей [184]. Л. Взаимное расположение фотоаппарата и фотографируемого геля. Б. Участок геля и один из возможных источников ошибок. Минимальное расстояние между различными полосами можно рассчитать с помощью тригонометрических функций. 1 — объектив фотоаппарата; 2 — полосы;
3 — гель.
чтобы они отражали проходящий свет. В результате на снимке получалась лишь та часть каждой полосы в геле, которая была ближе всего к фотоаппарату. Пробирки с водой не вносили никаких искажений в направлении, параллельном их оси, и поэтому расстояния между полосами в геле и на фотографии были пропорциональными.
Фиске [385] применил аналогичный прием при фотографировании столбиков полиакриламидного геля. Пробирки, одни из которых содержали столбики геля, а другие — обесцвечивающий раствор, устанавливали вертикально как можно ближе друг к другу в специальном штативе, изготовленном из пер-спекса.
Фотографии можно анализировать с помощью денситомет-рни. Фесслер и Бейли [379] показали, что существует прямая пропорциональная зависимость между количеством нанесенного белка и площадью соответствующего ему пика на денситограмме. И хотя этот метод во многих отношениях лучше непосредственной денситометрии, следует учитывать, что линейные отношения сохраняются лишь в ограниченном диапазоне концентраций и зависят от природы красителя и использованного метода окрашивания, а также от свойств фотоматериалов. Поэтому справедливость линейных отношений совершенно необходимо проверять при тщательно контролируемых условиях, используемых для количественных определений.
Был предложен и другой подход к измерению содержания белков в полученных на электрофореграммах фракциях )[ 1007]. Он основан на том, что между временем минимальной экспозиции фотопленки, необходимым для появления на фотографии изображения соответствующей полосы, и количеством белка в этой полосе наблюдается линейная зависимость. Авторы установили, что стандартная ошибка при количественном определении белков этим способом составляла ±2—4%.
Несмотря на наличие усовершенствованных методов фотографирования электрофореграмм, рекомендуется все-таки зарисовать полученную картину, особенно если на одной и той же электрофореграмме присутствуют и очень интенсивно и очень слабо окрашенные полосы, так как последние легко могут быть утрачены в процессе фотографирования и печатания изображений.
1.15.5. Высушивание полиакриламидных гелей
Высушенные полиакриламидные гели обладают рядом преимуществ перед влажными: они обычно не выцветают, радиоавто-графические определения в них в 20 раз чувствительнее [552] и их легче хранить.
Разработано несколько методов, позволяющих полностью удалять из геля воду без его сокращения.
Согласно одному из таких методов {357], гель, разрезанный в продольном направлении, кладут на влажную фильтровальную бумагу, которую помещают в воронку для отсасывания с мелкопористым фильтром. Сверху гель накрывают тонкой эластичной пластмассовой пленкой, а с боков герметизируют с помощью резиновых прокладок и силиконовой смазки. Затем в течение 1—2 ч гель выдерживают в вакууме, облучая его инфракрасной лампой, находящейся на расстоянии 30 см.
