Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Описана методика регистрации радиоактивных веществ в полиакриламидном геле с помощью инстагеля фирмы Packard ,[757]. Вымочень^е кусочки геля диспергируют в 3 мл воды и добавляют к ним 7 мл инстагеля. Смесь энергично встряхивают в течение нескольких минут при 41—42 °С, после чего помещают в ледяную баню. Такая процедура приводит к образованию однородной суспензии. Затем пробы выдерживают несколько часов в темноте и измеряют радиоактивность. Эффективность счета: 42% для 3Н и 87°/0 для 14С. Наблюдается лишь незначительное самопоглощение.
МЕТОДЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СЖИГАНИЯ
Сжигание проб перед определением в них радиоактивности применяют главным образом в тех случаях, когда в пробах содержится очень мало радиоактивного вещества. Такой метод основан на том, что при сжигании образца в присутствии кислорода 3Н превращается в 3Н20, 14С — в 14С02 и 35S — в 35S02. Образовавшиеся соединения можно определять либо в газовой фазе [690], либо после их поглощения в соответствующих растворителях с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика [623, 941, 992, 995]. Некоторые авторы [496, 850] проводят сжигание прямо в сцинтилляционных сосудах. В продаже имеется много типов приборов, содержащих автоматические устройства для сжигания. Преимущество методик, основанных на сжигании, состоит в том, что все пробы измеряются всегда при идентичных условиях, благодаря чему получаются сравнимые результаты и отпадает необходимость в поправках на тушение флуоресценции. Окрашенные гели тоже пригодны для измерения в них радиоактивности.
СЦИНТИЛЛЯЦИОННЫЙ МЕТОД ИЗМЕРЕНИЯ РАДИОАКТИВНОСТИ ПОСЛЕ РАЗРУШЕНИЯ СТРУКТУРЫ ГЕЛЯ
Разрушение структуры геля химическими агентами не препятствует измерению радиоактивности сцинтилляционным методом.
Уилкинсон [1422] предложил разрушать фрагменты крахмального геля толщиной 3 мм путем их обработки ультразвуком непосредственно в сцинтилляционных флаконах, в которые было добавлено по 2 мл воды. Радиоактивность измеряют в растворе Кинарда [676], содержащем 33% (объем/объем) тритона Х-100. Лагерстедт и Лангстон >[733] растворяли кусочки 1,5%-ного агарового геля, имеющие форму кубиков со стороной 3 мм, в 0,5 мл формамида и измеряли радиоактивность в смеси этанол— раствор жидкого сцинтиллятора в толуоле (1:7).
Полиакриламидные гели, сшитые с помощью бнс-акрилами-да, с трудом поддаются солюбилизации. Соответствующие методы основаны на деполимеризующем эффекте 30%-ной Н202
[1473]. Тишлер и Эпштейн [1294] подробно исследовали процесс солюбилизации 5, 7,5, 10 ,и 15%-ных полиакриламидных гелей в концентрированной перекиси водорода. Они показали, что этим способом из гелей извлекается более 8^у0 содержащейся (В них радиоактивности, а эффективность счйта достигает 23% для 3Н и 80% для 14С. На солюбилизацик/ не влияют ДСН, тритон Х-100 и мочевина. Эта методика применима и для крахмального ^геля. Она заключается в следующем. Хорошо высушенные фрагменты геля инкубируют с ОД мл 30%-ной Н202 при 50 °С в сосудах для счета радиоактивности. После растворения геля добавляют 1 мл растворителя NCS (фирма Nuclear Chicago) и 10 мл растворенного в толуоле жидкого сцинтиллятора. Если температура поднимается выше 50 °С, то возможна частичная потеря радиоактивности.
Гудман и Мацура [448] несколько модифицировали описанный метод. Они растворяли кусочки полиакриламидного геля (поперечно сшитого с помощью owc-акриламида) в смеси NH4OH—Н202 (1:99) в течение 4—8 ч (до просветления раствора) при 37 °С. Затем флаконы охлаждали до комнатной температуры и в них наливали по 10 мл раствора, содержащего 1 ч. растворителя BBS-3 (фирма Beckman) и 5 ч. растворенного в толуоле жидкого сцинтиллятора. Эффективность счета равнялась 13% для 3Н и 50% для !4С.
Паус [980] обнаружил, что полиакриламидные гели (сшитые с помощью бис-акриламида), концентрация которых не превышает 5%, можно перевести в раствор при инкубации с солуе-ном (фирма Packard) в течение 24 ч при температуре 60—65°С. Более концентрированные гели не поддавались заметному растворению, даже если инкубация продолжалась несколько дней. Иногда в растворах появлялся студенистый осадок, растворявшийся в жидком сцинтилляторе. Эффективность счета достигалась 31% для 3Н и 86% для 14С.
Чоулес и Цимм [227] предложили еще один способ разрушения структуры геля. Они заменили бис-акриламид на этилен-диакрилат; полиакриламидные гели, приготовленные с этим •сшивающим агентом, хорошо растворяются в щелочной среде. Кусочки геля встряхивают в течение 3—4 ч при 37 °С в плотно закрытых флаконах, содержащих по 0,5 мл смеси пиперидин — спиртовой раствор гиамина (9:1). Если растворение идет медленно, то следует добавить к смеси еще 0,1 мл пиперидина. Радиоактивность определяют в растворе Кинарда [676] с эффективностью 10% для 3Н.
Спиар и Ройзман [1218] гидролизовали сшитый этилендиа-крилатом полиакриламидный гель концентрированным раствором NH4OH. Исследуемые пробы адсорбировали на стеклянных «фильтрах и высушивали. Радиоактивность считали в жидком
сцинтилляторе на основе толуола. Эффективность счета колебалась в пределах 15—20% для 3Н и 65—70% для 14С.
