Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Джон и Миллер [633, 634] выявляли ^Б-белки во влажном крахмальном и полиакриламидном гелях. Однако, вообще, гели лучше высушивать перед проведением радиоавтографии, так как при этом чувствительность определения повышается примерно в 20 раз [552]. Амалди [35] продемонстрировал, что в
тонкой (3—5 мкм) пленке высушенного полиакриламидного геля при экспозиции длительностью 2 мес, можно определить радиоактивность 3Н даже в том случае, если она составляет всего 300 расп/мин. Вещества, меченные 32Р, легко определяются и без высушивания геля [531].
Лист фильтровальной бумаги, ацетата целлюлозы или геля (желательно высушенного) накрывают медицинской рентгеновской пленкой, зажимают между двумя металлическими пластинами с низким естественным фоном и оставляют на определенное время в защищенном от света прохладном месте. По окончании экспозиции рентгеновскую пленку проявляют.
Более детальное описание методики радиоавтографии читатель может найти в прекрасной книге Роджерса [1111].
Прескотт и Дэвид [1033] применили для радиоавтографии вместо рентгеновской пленку фирмы Polaroid. Она, по мнению авторов, близка по чувствительности к рентгеновской пленке, но не нуждается в оборудовании темной комнаты и не требует проявления — процедуры, занимающей много времени.
Радиоавтографию электрофореграмм на бумаге целесообразно проводить с помощью специального направленно сфокусированного счетчика [415], обеспечивающего определение 32Р и ИС с чувствительностью в 100—10 000 раз более высокой, чем при использовании фотопленки. Данные получаются сразу в виде зависимости интенсивности излучения от пройденного исследуемым веществом расстояния. Поэтому отпадает необходимость в последующем сканировании. Различаются полосы, отстоящие на 3 мм друг от друга. Для опытов с применением двойной метки можно использовать дискриминаторы энергии.
Тыква и Вотруба [1319] осуществляли сканирование высушенных гелей счетчиком с полупроводниковым детектором [1318]. Важное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет одновременно выявлять несколько радиоактивных нуклидов. При этом все последующие процедуры после разрезания и высушивания геля выполняются автоматически по заранее заданной программе. Описанный метод пригоден для определения 32Р, и 14С, но не позволяет измерять ВН.
Флуорография. Проведение радиоавтографии в присутствии 2,5-дифенилоксазола (ДФО), сцинтиллирующего при взаимодействии с |3-частицами, дает возможность повысить чувствительность определения 14С и 35S в 10 раз; кроме того, этим методом можно выявлять 3Н с такой же чувствительностью, как и J4C. Полосы, в которых радиоактивность 3Н составляет 500 расп./мин, удается обнаружить при экспозиции длительностью 1 нед X149].
Чтобы подготовить гели для определения в них радиоактивности, сначала их помещают на полчаса примерно в 20 объе-
мов диметилсульфоксида, затем повторяют эту процедуру со све^ жей порцией растворителя, после чего переносят на 3 ч в 4 объема 20%-ного (масса/масса) раствора ДФО в думетилсульфок-сиде (22,2%, масса/объем). Наконец, ,гели погружают на 1 ч в 20 объемов воды и высушивают в вакууме в течение 1 ч. Экспонирование рентгеновской пленки с сухим гелем производят при —70 °С. Эта методика пригодна как для окрашенных, так и нефиксированных гелей. (Диметилсульфоксид хорошо проникает через кожу; и поэтому работать с ним следует в резиновых перчатках.)
Рамсден j[ 1055] применил флуорографию для локализации радиоактивных полос на иммуноэлектрофореграммах. С этой целью раствор ДФО в диэтиловом эфире наливают на стеклянные пластинки и дают эфиру испариться, затем кладут на них высушенный гель, который сверху накрывают рентгеновской пленкой и оставляют в темном месте на несколько дней.
РЕГИСТРАЦИЯ РАДИОАКТИВНОСТИ В ИСКРОВОЙ КАМЕРЕ
Асард и др. |[56] описали фотоустройство для быстрого определения 7- и р-нуклидов, выпускаемое фирмой LKB-Producter АВ (Швеция) под названием радиохроматограм. Это — искро вая камера, которая представляет собой триод, состоящий из анода, вольфрамовой сетки и катода. Роль катода выполняет само радиоактивное вещество, испускающее электроны, которые образуют искры в пространстве между сеткой и анодом. Формирование искры — быстрый процесс, обычно занимающий 10~8 с. Картина, возникающая в искровой камере, фотографируется с помощью фотоаппарата фирмы Polaroid. Разрешающая способность прибора варьирует между 0,5 и 0,7 мм. Он обладает высокой чувствительностью: хорошие фотографии получаются даже тогда, когда радиоактивность 3Н в пробах составляет всего 100 пКи/см2, а радиоактивность 14С—10 пКи/см2. Общая активность 3Н в пробах, которую удается выявить, составляет около 0,5 нКи (1,1 ЫО3 расп./мии). Искровая камера пригодна для оценки хроматографических пластинок и электро-фореграмм, полученных на бумаге и в различных типах гелей.
С ее помощью результаты можно получать в 1000 раз быстрее, чем при использовании радиоавтографии, хотя и с несколько меньшим разрешением. Она удобна для проведения массовых определений, например, в области радиоиммунологии.
