Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Гааль Э. -> "Электрофорез в разделении биологических макромолекул" -> 81

Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.

Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул — М.: Мир, 1982. — 448 c.
Скачать (прямая ссылка): elektroforezvrazdeleniibiologicheskih1982.djvu
Предыдущая << 1 .. 75 76 77 78 79 80 < 81 > 82 83 84 85 86 87 .. 185 >> Следующая

Следует иметь в виду, что полиакриламидный гель, сшитый; с помощью этилендиакрилата, можно использовать только в. нейтральной или кислой среде, так как при щелочных pH ан неустойчив. Кейн и Питни [190] подчеркивают, что этот гель более прозрачен, чем гель, полученный с участием бис-акрилами-да, но обладает меньшей твердостью. Поэтому в нем образуются не очень четкие полосы и его труднее равномерно разрезать.
Если бг/с-акриламид заменить М^М'-диаллилтартардиамидом] в той же молярной концентрации, то образовавшийся полиакриламидный гель будет легко растворяться в 2%-ной йодной кислоте при комнатной температуре (20—30 мин) или при 37 °С. (10 мин) {40]. После проведения в таком геле электрофореза/ с применением щелочного буфера его сначала нейтрализуют уксусной кислотой и лишь после этого погружают в йодную кислоту. Его радиоактивность лучше всего определять в 0,3%-ном-растворе ДФО в ксилоле, содержащем 25% (объем/объем) тритона X-114 [38]. При желании в него можно также добавить. ДФОБ до конечной концентрации 0,2 г/л. Приведенная методика обеспечивает получение эффективности счета, равной 47%, для 3Н и 93% для 14С.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ УДЕЛЬНОЙ РАДИОАКТИВНОСТИ МЕЧЕНЫХ БЕЛКОВ ПОСЛЕ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
Хиден и Ланге [602] определяли нанограммовые количества-3Н-белков методом интерферометрии, а радиоактивность с помощью сжигания. Кейн и Питни [190] растворили сшитый эти-лендиакрилатом полиакриламидный гель в 1 М NH4OH (400 мм3 геля на 1 мл NH4OH), выдержав его в этом растворе в течение нескольких часов. Содержание белка устанавливали колориметрически (при 610 нм) по количеству связавшегося с ним красителя амидового черного 10 В. Для измерения радиоактивности использовали другие аликвотные пробы, из которых удаляли аммиак путем выпаривания их досуха при 65 °С. К остатку добавляли 0,2 мл воды и 1,5 мл растворителя NCS (фирма Nuclear Chicago), а затем оставляли его на несколько часов при комнатной температуре. Радиоактивность в пробах определяли с использованием жидкого сцинтиллятора на основе толуола. NCS можно заменить солуеном (фирма Packard) [545].
Альперс и Гликман [32] растворяли фрагменты полиакриламидного геля, сшитого с помощью этилендиакрилата в 0,3—
0,4 мл 1 М NaOH. Белок определяли по методу Лоури и др. [783], а радиоактивность — методом жидкостного сцинтилляци-онного счета, используя пробы по 0,2 мл после добавления к ним 1 мл NCS и инкубации в течение 1 ч при 65 DC.
II. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ БЕЛКОВ
И.1. Поведение белков при электрофорезе
Белки представляют собой макромолекулярные соединения, построенные из аминокислот. В состав белков различного происхождения входит всего лишь около 20 видов аминокислот, а все огромное разнообразие белков обусловлено различиями в составе и порядке чередования аминокислотных остатков в белковой молекуле.
С точки зрения электрофореза наиболее важное значение имеют свойства белков, связанные с их ионизацией. В каждой белковой молекуле содержится множество групп, способных отдавать или принимать протоны, что приводит к образованию в первом случае отрицательно заряженных, а во втором положительно заряженных групп. Преобладание одного из этих процессов зависит от состава данного белка, а также от окружения, в котором находятся его молекулы, главным образом от pH среды. В кислой среде основные группы протонированы, тогда как диссоциация кислотных групп подавлена, поэтому белки оказываются заряженными положительно. В щелочных растворах основные группы не имеют заряда, а карбоксильные группы легко диссоциируют, вследствие чего в молекуле образуется избыток отрицательно заряженных групп. Суммарный заряд белковой молекулы зависит от pH среды, а также от числа и характера ионизируемых групп.
При определенном pH молекулы данного белка содержат равное число положительно и отрицательно заряженных групп: это значение pH называется изоэлектрической точкой (ИЭТ) белка. При pH, соответствующем ИЭТ, суммарный заряд молекулы равен нулю, поэтому в электрическом поле белок остается неподвижным. Для каждого белка характерна определенная ИЭТ. При значениях pH, лежащих выше ИЭТ, белки заряжены отрицательно, а при значениях pH, лежащих ниже ИЭТ, положительно.
ИЭТ можно определить путем измерения электрофоретической подвижности белка при разных pH. С этой целью строят график, выражающий зависимость найденной подвижности белка от pH, и путем интерполяции находят значение pH, при котором электрофоретическая подвижность белка равна нулю. По-
скольку различные белки содержат те или иные виды ионизируемых групп в разных соотношениях, кривые, характеризующие зависимость подвижности белков от pH, непараллельны и нелинейны.
Другой метод определения ИЭТ основан на электрофоретическом разделении белков в среде с градиентом pH. В этом случае каждый белок движется к той зоне градиента, в которой значение pH соответствует его ИЭТ. Этот метод носит название изоэлектрического фокусирования. Он был детально описан в гл. 1.12.
Значение ИЭТ белка зависит от ионного состава среды, так как в молекулах белка присутствуют группы, связывающие не только водородные и гидроксильные ионы, но и другие кятионы {например, JMa+, К+, Са2+ или Mg2+) и анионы (фосфат, хлорид и Др.).
Предыдущая << 1 .. 75 76 77 78 79 80 < 81 > 82 83 84 85 86 87 .. 185 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed