Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Гааль Э. -> "Электрофорез в разделении биологических макромолекул" -> 79

Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.

Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул — М.: Мир, 1982. — 448 c.
Скачать (прямая ссылка): elektroforezvrazdeleniibiologicheskih1982.djvu
Предыдущая << 1 .. 73 74 75 76 77 78 < 79 > 80 81 82 83 84 85 .. 185 >> Следующая

ПРЯМОЕ ИЗМЕРЕНИЕ РАДИОАКТИВНОСТИ
Одним из наиболее простых методов определения радиоактивности в высушенных фрагментах поддерживающей среды является прямой подсчет числа распадов в проточном счетчике [891]. Необходимо учитывать самопоглощение среды.
При измерении радиоактивности в жидкостном сцинтилля-ционном спектрометре тщательно высушенные полоски бумаги или ацетата целлюлозы помещают непосредственно в раствор жидкого сцинтиллятора, так как эти материалы либо прозрачны, либо растворимы в таких жидкостях {255]. Некоторые авторы измеряют радиоактивность в агарозном [1269] или полиакриламидном {1376] геле без предварительной обработки их жидким сцинтиллятором. По другой методике {1249] кусочки крахмального геля сначала гомогенизируют в 0,4 мл триметил-аммонийгидроксида, а затем полученный гомогенат смешивают с 10 мл раствора Брэя [166], содержащего 5%-ный «кабосил» (фирма Cabot, США), и измеряют радиоактивность. К сожалению, указанные методы довольно малочувствительны |[470].
Бишоп и др. [124] определяли радиоактивность высушенных на фильтровальной бумаге кусочков полиакриламидного геля в жидком сцинтилляторе на основе толуола, содержащем 2,5-бис {б'-грег-бутилбензоксазолил (2') ] тиофен (ББОТ).
Бойд и Митчелл [157] при измерении содержания радиоактивности в полиакриламидных гелях предварительно замещали в них воду неполярными растворителями. Для этого кусочки геля в течение 5 ч или дольше пропитывали сначала в растворителе, содержащем 2,5 г фосфорновольфрамовой кислоты, а затем такой же период времени в смеси уксусная кислота — моно-этиловый эфир этиленгликоля (1:1). Наконец, их выдерживали не менее 3 ч в жидком сцинтилляторе (3 г ДФО + ОД6 г ДФОБ в 1 л толуола), после чего отбирали 5 мл этой жидкости и определяли в ней радиоактивность. Эффективность счета составляла 81% ±12% для 14С и 23% —Для 3Н. При такой обработке из геля вымывалось менее 3% белка.
МЕТОД элюции
Метод элюции радиоактивных веществ из фрагментов разрезанной поддерживающей среды с последующим ее удалением и определением радиоактивности в жидкостном сцинтилляцион-ном спектрометре [82] нашел широкое распространение, хотя он трудоемок и занимает много времени. Белки можно элюировать 0,1%-ным раствором ДСН непосредственно в сцинтилляцион-ные сосуды и в них же измерять радиоактивность после встряхивания их при 37 °С в течение 3—5 ч с 10 мл эмульгирующего сцинтиллятора инстагель фирмы Packard [1185]. Эффективность счета равнялась 7% для 3Н и 33% для 14С.
Самый большой недостаток таких методик заключается в том, что в процессе элюции происходит разведение радиоактивных веществ, и поэтому перед определением их иногда прихо-
дится снова концентрировать. Льюис и Кларк (763] предложили применять электроэлюцию, предотвращающую разбавление раствора. /
/
РАСТВОРЕНИЕ ВЕЩЕСТВ, ПОДВЕРГНУТЫХ ЭЛЕКТРОФОРЕЗУ
Для определения радиоактивности после электрофореза целесообразно исследуемые вещества перевеет^ в раствор. При этом меченые соединения освобождаются от поддерживающей среды, которую либо удаляют из сцинтилляционных сосудов, либо (чаще) оставляют в них, так как она уже не влияет на измерения. Многие радиоактивные вещества, находящиеся на твердой подложке, такой, как бумага фирмы Whatman, переводят в раствор в сцинтилляционных сосудах с помощью кислого поверхностноактивного вещества био-солв BBS-3 (фирма Beckman) [855]. Жидкий сцинтиллятор в этом случае состоит из 4 г ДФО, 0,2 г ДФОБ, 170 мл био-солва BBS-3, 60 мл воды и 770 мл толуола. Обнаруживается более 90% радиоактивности.
Показано [93], что радиоактивные белки солюбилизируются в 0,5 мл растворителя NCS (фирма Nuclear Chicago) за 2 ч при 65 °С. В конце этого периода кусочки полиакриламидного геля разбухают (их объем увеличивается в 3—4 раза) и из них освобождаются радиоактивные материалы. Эффективность счета в жидком сцинтилляторе на основе толуола составляет 38°/» для 3Н и 82% для 14С. Метод применим также и для агарознополиакриламидных гелей. Однако концентрированные полиакриламидные гели требуют более длительного времени инкубации, так как медленно набухают в NCS. Добавление к инкубационной смеси 10% воды ускоряет этот процесс [1478].
Меченную тритием РНК элюировали из кусочков полиакриламидного геля, обрабатывая их при 60°С 0,5 мл 10%-ного пиперидина [777]. После выдерживания смеси в течение нескольких часов во флаконах для счета радиоактивности раствор высушивали, а к остатку приливали 0,5 мл воды. Это приводило к резкому набуханию гелей, объем которых становился во много раз больше обычного. Затем в сосуды вносили по 15 мл смешивающегося с водой жидкого сцинтиллятора и измеряли количество метки. Выявлялось более 90% гидролизованной РНК.
Радиоактивность меченых белков можно также измерить после их освобождения из полиакриламидного геля под действием протеаз [135] или гуанидинхлорида i[808]. Кусочки геля инкубируют в 1 мл 6 М раствора гуанидинхлорида в течение 12 ч при 90 °С, после чего к ним добавляют жидкий сцинтиллятор, содержащий 33% тритона Х-100. Окрашенные гели тоже можно анализировать этим способом. Эффективность счета для 3Н составляет 12%.
Предыдущая << 1 .. 73 74 75 76 77 78 < 79 > 80 81 82 83 84 85 .. 185 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed