Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Концентрация пробы при ИЭФ не имеет столь решающего значения, как при гель-электрофорезе, а осаждение белков в их изоэлектрических точках не влияет существенно на процесс разделения.
Особое преимущество ИЭФ в геле заключается в том, что его легко сочетать с другими методиками, такими, как иммуно-электрофорез и электрофорез в направлении, перпендикулярном к перемещению молекул при ИЭФ.
Продолжительность самого фокусирования в геле обычно меньше, чем в растворе с градиентом плотности, однако много времени занимают последующие процедуры, а именно фиксация и окрашивание белков, обесцвечивание фона, денситометрия или фотографирование полученных полос и, наконец, измерение градиента pH. Последняя процедура сложнее и менее точна, чем при ИЭФ в растворе.
ИЭФ в геле в качестве препаративного метода имеет лишь ограниченное применение, но, учитывая его быстроту и дешевизну, целесообразно использовать этот метод в предварительных опытах до осуществления ИЭФ в большом масштабе.
Большинство работ по ИЭФ в геле выполнено с применением полиакриламидного геля, так как остальные употребляемые при электрофорезе гелеобразующие вещества содержат заряженные группы и, следовательно, при работе с ними возникает электроэндосмос, влияющий на результаты разделения. Правда, недавно появилась одна статья [631], в которой описаны способ очистки агарозы на QAE-сефадексе и применение этого очищенного препарата для ИЭФ в геле.
Принцип гель-электрофореза основан «а различиях в зарядах и размерах молекул: чем больше эти различия, тем лучше разделение. При проведении же ИЭФ эффект молекулярного сита в геле оказывается вредным, особенно для крупных молекул, так как гели с мелкими порами задерживают их движение, что сильнее всего сказывается в зонах pH, близких к изо-электрическим точкам исследуемых веществ. Поэтому важно, чтобы гель обладал минимальным эффектом молекулярного сита. Добиться этого можно снижением общей концентрации акриламида и подбором соответствующего отношения между содержанием акриламида и Ы/Ы'-метиленбисакриламида. В гл. 1-12 было показано, что гели с крупными порами образуются при низкой общей концентрации мономеров (1—3% Т) или при высоком отношении бис-акриламида к акриламиду (10—50%
С) [1109]. В то же время следует помнить, что в обоих случаях уменьшается механическая 'прочность геля, возникают (нежелательное прилипание его к стенкам и искажение формы поверхности. Для разделения большинства белков пригоден полиакриламидный гель, содержащий около 5% акриламида.
Полиакриламидный гель, как правило, готовят обычным способом лутем полимеризации, инициируемой персульфатом, или фотополимеризации с участием рибофлавина. Правда, фотополимеризация применима лишь тогда, когда амфолиты-но-сители охватывают или весь диапазон pH, или его кислую область с pH не выше 5—8 [1456]. На полимеризацию с персульфатом амфолиты не оказывают влияния, поэтому их можно добавлять к исходной смеси мономеров и катализатора. Другой способ получения гелей для ИЭФ заключается в том, что сначала гель формируют без амфолитов, затем отмывают дистиллированной водой от непрореагировавших мономеров и остатков катализатора и, наконец, уравновешивают с амфоли-тами-носителями, вымачивая его в соответствующем растворе.
Во многие прописи для приготовления полиакриламидного геля для ИЭФ входит ТЕМЭД, однако без него вполне можно обойтись. Предполагают, что его роль выполняет смесь веществ, содержащихся в амфолине [868, 1098].
Если необходимо нанести на гель большой объем разбавленного белкового раствора, то его можно смешать с гелеобразующим раствором перед проведением полимеризации. Однако при этом возникают два источника ошибок. Один из них заключается в том, что в процессе полимеризации может произойти химическая модификация белков [168, 362, 877, 1153]. Наиболее серьезная опасность образования артефактов исходит от персульфата, поэтому при исследовании чувствительных белков лучше воспользоваться фотополимеризацией. Второй источник ошибок связан с возможностью иммобилизации бел-ков в теле. Чтобы избежать обоих видов артефактов, гель следует формировать в отсутствие белков и перед нанесением проб подвергать его преэлектрофокусированию. Для предотвращения денатурации белков под действием кислых или щелочных электродных растворов рекомендуется поверх образца наносить слой раствора амфолитов-носителей с той же концентрацией, что и в геле (обычно 1—2%). Разумеется, если исследуемый раствор наносят на поверхность геля, то он должен содержать достаточное количество сахарозы или глицерина, обеспечивающее разницу в плотности между ним и находящимся выше слоем электролита.
Иэоэлектрическое фокусирование в столбиках полиакриламидного геля. Эта методика очень сходна с описанным Дэвисом [281] диск-электрофорезом, и поэтому для нее пригодны
все типы приборов, как самодельные, так и коммерческие, предназначенные для диск-электрофореза в столбиках геля (гл. 1.11). В катодный сосуд заливают 0,2—0,4%-ный раствор три-зтаноламина, этилендиамина, этаноламина или NaOH, а в анодный—серную или ортофосфорную кислоту. В аппаратах прямоугольной формы электроды следует располагать вдоль центральной линии, а в цилиндрических — по их оси. Это гарантирует одинаковое падение напряжения во всех трубках.
