Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
[1260]:
Е —
D [d (pH)/dx]
[d«/d (pH)] '
проведения всех процедур 'В замкнутой системе приборов заключается в том, что растворы не поглощают при этом атмосферный СО2. Детальные описания автоматизированной методики можно найти в других работах [642, 1161].
ИЭФ В РАСТВОРАХ, НЕ СОДЕРЖАЩИХ ДРУГИХ ДОБАВОК,
КРОМЕ АМФОЛИТОВ-НОСИТЕЛЕЙ
Вэлмет [1333] разработал методику ИЭФ без стабилизации зон предварительно сформированным градиентом плотности. Сконструированный им прибор представляет собой прямоугольную коробку и состоит из ряда U-образных трубок, расположенных между его двумя составными частями. Крышка нижней половинки прибора и дно верхней имеют U-образные выемки. Поэтому при накладывании одной -половинки на другую между ними создаются сообщающиеся между собой U-образные ячейки. Обе части этой конструкции охлаждаются проточной водой. По бокам располагаются платиновые электроды, отделенные от раствора амфолитов и белков фильтрами из пористого стекла. Перед установкой электродов анод и катод смачивают соответственно слегка разбавленной фосфорной кислотой и органическим основанием или NaOH. После завершения ИЭФ верхнюю часть аппарата снимают, при этом ячейки оказываются изолированными друг от друга -и содержащийся в каждой из них раствор можно легко извлечь, не подвергая его нежелательным воздействиям диффузии и риску загрязнения соседними фракциями. Этот метод, пригодный для разделения больших количеств белка, известен под названием зонального конвекционного изоэлектрического фокусирования. Вэлмет [1333] применил его для фракционирования 1 г белка в объеме 50 мл. Наблюдающееся иногда выпадение в осадок белков в их изоэлектрических точках не влияет здесь на протекание опыта, так 'как белок оседает, не нарушая процесса фокусирования остальных компонентов смеси. Остается лишь удивляться тому, что метод, обладающий такими преимуществами, не нашел еще достаточно широкого применения.
ИЭФ можно проводить также в установке, созданной Йер-теном [565, 566] для электрофореза со стабилизацией зон при помощи вращения разделительной колонки со скоростью 40 об/мин (см. рис. 6). Фокусирование осуществляют в кварцевой трубке, покрытой слоем метилцеллюлозы для предотвращения электроэндосмоса. Белковые полосы регистрируют путем сканирования трубки -в ультрафиолетовом свете.
Очень простую процедуру ИЭФ описали Мако и Стегеманн [795]. Они взяли полиэтиленовую трубку длиной 100 см с внутренним диаметром 4 мм и, сделав на ней метки через каждые
2,5 см, намотали ее в виде опирали на медный стержень диаметром 2 см. Затем в трубку налили около 10 мл 10%-ного водного раствора сахарозы, содержавшего 1 % амфолина. Поверх этого раствора наслоили сначала 0,5 мл исследуемой пробы в 5%-ной сахарозе, а потом еще 0,5 ;мл 1%-ного раствора амфолина в 5%-ной сахарозе. В анодный и катодный концы трубки внесли по 0,5 мл соответственно 0,1%-ной фосфорной кислоты ц '0,4%-ного раствора этанол амина, содержавшего 0,02% метилового красного. Краситель в процеосе ИЭФ перемещался к аноду и постепенно накапливался около него. Во время опыта всю трубку погружали либо в ледяную, либо в термостатированную при 2°С водяную баню таким образом, чтобы над поверхностью охлаждающей жидкости выступали лишь концы трубки. В течение первых 12 ч фокусирования к электродам прикладывали напряжение 600 В, а на последующем этапе (48 ч) напряжение повышали до 1000 В. После окончания ИЭФ трубку быстро замораживали в жидком азоте, разрезали на кусочки в соответствии с ранее сделанными метками и содержимое каждого кусочка помещали в отдельный сосуд. Таким способом «в одном опыте удавалось фракционировать 10—50 мг белка, причем разделение было очень хорошим, так как ;в трубке длиной 1 м создавался весьма пологий градиент pH. Осаждение отдельных белков в их изоэлектрических точках вызывало меньше «искажений, чем при традиционных методах разделения в градиенте плотности.
ИЭФ В ГЕЛЯХ
Методика ИЭФ в полиакриламидном геле была опубликована почти одновременно целым рядом лабораторий [71, 201, 202, 269, 364, 749, 1098, 1455—1457].
Этот метод обладает по крайней мере такой же или даже более высокой разрешающей способностью, чем ИЭФ в градиенте плотности. Отчасти это объясняется тем, что в геле фиксация белков осуществляется значительно быстрее, чем в растворе с градиентом плотности, и за столь короткое время зоны не успевают заметно расшириться.
В техническом отношении ИЭФ в геле представляет собой очень простую процедуру. Его 'можно осуществить в любом приборе, предназначенном для электрофореза на пластинах или в столбиках геля. Разработаны и еще более простые аппараты специально для ИЭФ в геле, которые ’можно легко собрать в лабораторной мастерской или изготовить по принципу «сделай сам».
При использовании пластины геля одновременное исследование нескольких образцов проводят в одном и том же геле;
если же гель формируют в виде столбиков, то пробы наносят на разные гели или применяют методику расщепленного геля.
В зависимости от способа выявления белков для анализа обычно достаточно нескольких микрограммов белка или даже еще меньше.
