Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Время, необходимое для завершения фокусирования, определяется рабочим диапазоном pH и приложенным напряжением. Чем уже интервал pH, тем больше требуется времени. Длительность процедуры можно сократить, повысив напряжение. Однако применение максимально допустимого напряжения, зависящего от конструкции прибора, ограничивается выделением тепла. Во время ИЭФ происходит общее снижение проводимости, в результате чего при поддержании напряжения на постоянном уровне сила тока постепенно падает. Это позволяет в ходе опыта повышать напряжение. Следует отметить, что если при данном напряжении сила тока не изменяется, то это еще не означает окончания процесса фокусирования. Для достижения равновесия ИЭФ необходимо продолжать еще до-
вольно длительное время после того, как при начальном напряжении сила тока снизится до минимального значения.
Среда для ИЭФ в градиенте плотности. Для стабилизации зон при ИЭФ чаще всего используют градиент плотности сахарозы, но применяют также и другие вещества, такие, как 1,2-пропандиол (этиленгликоль [9]), глицерин, маннит, сорбит, декстран и фиколл. Глицерин имеет некоторые преимущества перед сахарозой в области pH выше 10, где она частично диссоциирует и искажает определяемые во фракциях величины pH [1344J. Обычно работают с линейными градиентами плотности, однако для повышения их емкости иногда создают и нелинейные градиенты [1259].
Фредрикссон и Петтерссон [404] проводили ИЭФ в градиенте плотности тяжелой воды. Они использовали колонку объемом 1,5 мл, сделанную в кювете фотометра [643], «а дно которой был помещен электрод, не выделяющий газа. В колонку последовательно наслаивали три раствора с разной концентрацией оксида дейтерия. Градиент плотности возникал в результате свободной диффузии молекул между слоями. Путем измерения коэффициента преломления было показано, что полученный градиент имеет очень (высокую степень линейности. Он составлял 0,016 г/см4, т. е. был в два раза круче градиента плотности раствора сахарозы в колонке фирмы LKB на 110 мл (максимальная концентрация сахарозы 500 г/л). Позднее
Фредрикссон [403] детально исследовал возможности применения градиентов концентрации тяжелой воды.
Извлечение белков после ИЭФ. Если иэоэлектрическое фокусирование преследует не только аналитические цели, то белки необходимо извлечь из разделенных фракций. Поскольку амфолиты-носители — это низкомолекулярные вещества, одним из наиболее простых методов отделения их от белков является диализ против соответствующего буферного раствора. Но так как диализ отнимает много ©ремени, можно с успехом воспользоваться другими методами: гель-фильтрацией [1342], осаждением ,белков сульфатом аммония [928], хроматографией через слой смеси ионообменных смол [174] или ультрафильтрацией с одновременным диализом [407].
Определение изоэлектрических точек веществ с помощью ИЭФ. Помимо разделения белков и других амфотерных соединений ИЭФ служит удобным и надежным методом, позволяющим установить ИЭТ каждого выделенного вещества при практически нулевой ионной силе. В соответствии с основным принципом ИЭФ белок движется в колонке с градиентом pH до тех пор, пока не достигнет слоя, pH которого равен ИЭТ данного белка. Следовательно, ее можно определить простым измерением pH фракции, содержащей этот белок.
В случае ИЭФ под термином разрешающая способность подразумевается величина наименьшего различия между ИЭТ двух белков, которая еще позволяет отделить их друг от друга. Ее можно рассчитать по формуле, выведенной Свенссоном
где D — коэффициент диффузии белка в см2/с, х — координата вдоль направления электрического тока, Е — напряженность поля в точке фокусирования в В/ом и и — электрическая подвижность при pH, близком к ’изоэлектрической точке данного белка, в см2/(В>с).
Из приведенного уравнения видно, что чем уже диапазон pH, тем выше разрешающая способность метода. В интервале pH, равном одной единице, удается разделить белки, различающиеся по ИЭТ на 0,02 единицы pH. На практике точность и воспроизводимость определения ИЭТ зависят от нескольких факторов.
Очень важное значение имеет правильное фракционирование градиентной колонки. В конце ИЭФ отдельные зоны содержат высокие концентрации белков, и, ,чтобы избежать интенсивной диффузии, их следует выделять, как можно быстрее. Эту скорость ограничивает лишь опасность механического смешивания разделенных фракций, которое должно быть сведено к минимуму.
Чем меньше объем собранных фракций, тем надежнее измерение ИЭТ. Однако этот объем обычно определяется конструкцией рН-метра. Зачастую фракции приходится разводить, чтобы получить объем, достаточный для измерения pH. Но в этом случае следует помнить, что разведенные амфолиты-носители обладают меньшей буферной емкостью. Кроме того, нужно принимать специальные меры для защиты растворов от влияния атмосферного СОг. Значения pH зависят также от температуры. Отсюда вытекает, что ИЭФ и измерение pH лучше проводить при одной и той же температуре.
Разделение содержимого колонки с градиентом плотности на фракции и определение в каждой из них количества белка и pH занимают довольно много времени. Но все эти операции можно автоматизировать, если использовать рН-метр и спектрофотометр с проточными кюветами. Присоединив же к этим приборам самописцы, можно одновременно регистрировать градиент pH и распределение белков. Такая система обеспечивает получение более полной информации, чем в том случае, когда все операции выполняются вручную. Еще одно преимущество
