Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Гааль Э. -> "Электрофорез в разделении биологических макромолекул" -> 55

Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.

Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул — М.: Мир, 1982. — 448 c.
Скачать (прямая ссылка): elektroforezvrazdeleniibiologicheskih1982.djvu
Предыдущая << 1 .. 49 50 51 52 53 54 < 55 > 56 57 58 59 60 61 .. 185 >> Следующая

Время, 'необходимое для ИЭФ, зависит от размера и концентрации гелей, а также от приложенного напряжения. Величина последнего ограничена выделением тепла. Для гелей диаметром 5 мм и длиной 65 мм рекомендуется применять силу тока не более 2 мА на трубку [1456]. По мере снижения проводимости в процессе образования градиента pH напряжение можно довести до 300—400 В.
Описан еще один очень простой метод ИЭФ в геле [364]. В нем используют стеклянные трубочки длиной 150—200 мм с внутренним диаметром 0,3 см. Полиакриламидные гели (8% Т), содержащие 1 % амфолина, готовят с помощью фотополимери-зации. Нижние концы трубочек опускают в маленькие сосуды, в которых находятся платиновые электроды и небольшой объем 1%-ного этилендиамина. Пробы в 1%-ном растворе амфолина наносят поверх гелей, а над ними аккуратно наслаивают еще 0,5—1 мл 1%-ного амфолина. В каждую трубочку вставляют платиновый электрод, погружая его в самый верхний слой раствора.
Изоэлектрическое фокусирование в пластинах полиакриламидного геля. Предложена методика проведения ИЭФ в тонком слое 5%-ного полиакриламидного геля, содержащего 2% амфолина [71]. Гель получают путем фотополимеризации в кювете, образованной двумя стеклянными пластинками, которые удерживаются на расстоянии 1 мм друг от друга с помощью прокладок из силиконовой трубки. Поверхность одной из пластинок силиконизируют. Всю конструкцию скрепляют большими пружинными зажимами для бумаги. По окончании полимеризации силиконизированную пластинку отделяют от геля, который остается прикрепленным ко второй пластинке. Для внесения пробы кусочек фильтровальной бумаги пропитывают определенным объемом исследуемого раствора и вставляют в щель, прорезанную в слое геля. Затем пластинку с гелем переносят в пластмассовую коробку и укладывают на два горизонтально расположенных угольных стержня, служащих электродами. Катод и анод смачивают 5%-ными растворами соответственно этилендиамина и фосфорной кислоты. На время опыта в коробку помещают насыщенную водой синтетическую губку для создания в камере влажной атмосферы. ИЭФ проводят в
течение 16 ч при напряжении 400 В. Сила тока, равная вначале 15 мА, падает в конце до 2 мА.
Другие авторы [749] готовили гель в плоской форме. Вначале в нее укладывали стеклянные полоски, располагая их параллельно друг другу по бокам формы, а на оставшейся площади полимеризовали слой геля. После полимеризации стекла убирали, а освободившееся пространство заполняли электродными растворами, наливая с одной стороны формы 0,1 М фосфорную кислоту, а с другой — 0,1 М этилендиамин. Таким способом обеспечивали хороший контакт между гелем и электродными растворами, в которые помещали угольные или платиновые электроды. Затем форму с гелем накрывали крышкой с прикрепленной внутри нее влажной губкой, предотвращавшей высыхание геля.
Для формирования геля применяют как фотополимеризацию, так и химическую полимеризацию, инициируемую персульфатом [749]. Во втором случае в гелеобразующие растворы амфолин не добавляют, полученный гель промывают несколькими порциями воды, а затем наносят на него слой 24%-ного раствора амфолина.
В 1975 г. в продаже появилась новая продукция, созданная специально для ИЭФ в геле. Фирма LKB (Швеция) объявила
о выпуске готовых для употребления пластинок размерами 245Х1ЮХ1 мм, покрытых слоем полиакриламидного геля, содержащего 2,4% амфолитов-носителей (амфолина) в интервале pH 3,5—9,5, 5% Т и 3% С. Каждая пластинка предназначена для одновременного фракционирования 24 проб, но при желании от нее можно отрезать кусочек нужного размера для размещения на нем меньшего числа образцов. Нанесение проб осуществляется очень просто с помощью входящих в комплект специальных маленьких бумажек, которые сначала погружают в исследуемый раствор, а затем накладывают на поверхность геля. Таким путем удается ввести в гель 10 мкл раствора, содержащего несколько микрограммов белка. По окончании ИЭФ, продолжающегося около 1,5 ч, пластинки фиксируют и окрашивают. [Подробности можно найти в сообщении фирмы LKB; журнал Science Tools, 22, 15 (1975)].
При изучении с помощью ИЭФ микрогетерогенности ферментов было показано [1207], что чувствительность метода возрастает, если исследуемые вещества наносят непосредственно на поверхность геля, не пользуясь для этого кусочками фильтровальной бумаги. Эти авторы обнаружили также, что бумага избирательно сорбирует отдельные компоненты смеси ферментов, если ее накладывают на гель с предварительно сформированным градиентом pH в такое место, где pH ниже изоэлектрических точек этих белков.
Кратко рассмотренные здесь варианты ИЭФ оказались чрезвычайно полезными для разделения микрограммовых количеств весьма различных белков. Поэтому был предпринят ряд попыток расширить область применения ИЭФ в геле как в сторону увеличения, так и в сторону уменьшения его масштабов.
Факторы, влияющие на использование ИЭФ в геле в препаративных целях, детально исследовали Финлейсон и Чрамбах [381], которые работали оо стеклянными трубками различного внутреннего диаметра от 6 до 18 мм. Они установили, что в зависимости от расстояния между соседними зонами в каждой из них может содержаться 200—800 мкг белка на 1 см2 поперечного сечения геля. Результаты получались лучше тогда, когда белки наносили на поверхность уже готового геля, а не смешивали с гелеобразующим раствором.
Предыдущая << 1 .. 49 50 51 52 53 54 < 55 > 56 57 58 59 60 61 .. 185 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed