Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Нижний конец колонки имеет форму конуса и непосредственно соединяется с выводящим капилляром.
Сначала амфолиты-носи-тели с выбранным диапазоном pH смешивают с растворами, используемыми для создания градиента плотности. При работе с амфолином фирмы LKB его конечная концентрация составляет обычно 1%. Для получения необходимого градиента плотности в описанном выше приборе в нижнюю часть колонки наливают 50%-ную (масса/объем) сахарозу, а в верхнюю—1%-ную или чистый раствор амфолина. Это делают с помощью градиентного смесителя, а при его отсутствии наслаивают друг на друга растворы сахарозы с постепенно убывающей плотностью. Исследуемую пробу можно смешать с одним из таких слоев. При использовании смесителя ее добавляют либо к легкому, либо к тяжелому раствору сахарозы. Кроме того, пробу можно нанести поверх сформированного градиента. После этого электродные сосуды наполняют соответствующими растворами. В катодный сосуд наливают разбавленный раствор этанолами-на или другого сильного органического основания (в случае же сильно основных белков используют гидроксид натрия), а в анодный сосуд — разбавленную серную или фосфорную кислоту.
Далее с помощью специального приспособления, рас-
положенного в верхней части собранного аппарата, открывают клапан на нижнем конце электродной трубки, который обычно удерживается в закрытом положении спиральной пружиной. При этом образуется жидкостный -контакт между электродами. Затем включают термостатирующее устройство и прикладывают к электродам постоянное напряжение величиной 200— 1200 В, стараясь, чтобы сила тока -не превышала 10 мА.
Обычно для завершения ИЭФ достаточно 24—72 ч, после чего электродный клапан закрывают и содержимое колонки фракционируют через выводящий капилляр, не допуская смешивания полученных зон. Положение сфокусировавшихся белков можно регистрировать, измеряя их поглощение в фотометре с проточной кюветой, соединенном с соответствующим самописцем. Величину pH отдельных зон, собранных вручную или с помощью коллектора фракций, определяют на рН-метре. Поскольку изоэлектрические точки белков и окружающих их амфолитов должны быть одинаковыми, измеренная .величина pH каждой данной фракции соответствует изоэлектрической точке содержащегося в ней белка. При этом надежность полученных данных существенно зависит от объема фракций и чувствительности использованного рН-метра.
Теоретически не важно, находится ли в верхней части колонки катод или анод, однако на практике приходится иметь дело с факторами, зависящими от полярности электродов.
Некоторые белки имеют тенденцию выпадать в осадок при величинах pH, равных их изоэлектрическим точкам, особенно если на колонку с градиентом плотности нанесены большие количества белка. Оседающий белок может перемешать слои, расположенные ниже уровня его образования. Поэтому в тех случаях, когда заранее известно, что определенные компоненты белковой смеси выпадут в осадок, электроды следует расположить таким образом, чтобы изоэлектричеекая точка белка с наименьшей растворимостью была ниже изоэлектрических точек других изучаемых белков. Иногда осаждение белков можно предотвратить добавлением таких веществ, как мочевина в концентрации 2—8 М .[128, 627, 1183] или неионные детергенты (tbhih 80, эмаоол, бри 39, тритон Х-100) в концентрации 0,1—0,5% [886, 1343, 1344].
Осадок белка, образовавшийся в его изоэлектрической точке, как .правило, можно вновь растворить, если сдвинуть pH в ту область, где этот белок растворим [878, 1344]. В некоторых случаях добавление к белковой смеси тиоловых соединений в концентрации около 10~4 М также (препятствует денатурации и осаждению белков [1361].
Другой фактор, который необходимо принимать во внимание при выборе положения электродов, определяется составом
- +
It
1-
самих амфолитов-носителей. В начале ИЭФ они обычно равномерно распределены в растворе, но в дальнейшем под влиянием электрического поля отдельные компоненты смеси амфолитов фокусируются в соответствии с их изоэлект-рическими точками. Это сопровождается изменениями электропроводимости, зависящей от числа и относительного содержания индивидуальных веществ ,в смеси амфолитов. В результате возникают зоны с различной проводимостью, причем зоны с низкой проводимостью, в которых выделяется большее количество тепла, сильнее подвергаются тепловой конвекции. При использовании амфолинов фирмы LKB области с пониженной проводимостью находятся вблизи pH 7 [502]. Чтобы свести к минимуму тепловую конвекцию, участки с самой низкой проводимостью должны располагаться в верхней части градиентной колонки, но при условии, что это не приведет к осаждению белков.
Упомянутые выше колонки фирмы LKB обладают большой емкостью. Даже меньшая из них имеет объем 110 мл и вполне пригодна для препаративных опытов, но не очень удобна, когда требуется разделить небольшие количества белка <в аналитических целях. Поэтому было приложено много усилий по созданию аппарата -для ИЭФ еще меньшего объема.
Остерман [948] описал 'колонку для ИЭФ ,в градиенте плотности с рабочим объемом 12 мл. По конструкции она аналогична стандартным приборам фирмы LKB и в то же время на* столько проста, что может быть изготовлена в любой лаборатории.
