Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Для извлечения белков после ИЭФ отдельные сегменты, содержавшие белковые полосы, вырезали из геля и тщательно отмывали от амфолина. Эти кусочки геля гомогенизировали с помощью стеклянного гомогенизатора в 12,5%-«ой ТХУ, которую затем удаляли путем последовательных промываний 50%-ным спиртом, абсолютным спиртом и эфиром. Наконец, из высушенного эфиром геля 0,1 М муравьиной кислотой экстрагировали белки. При разделении методом ИЭФ радиоактивных протеолитичеоких фрагментов гемоглобина выход полипептидов составлял 75%. Такая процедура приводит к денатурации разделенных белков, но она вполне пригодна в тех случаях, когда полученный материал предназначен для определения его аминокислотного состава.
Сузуки и др. [1253] предложили использовать электрофорез для выделения белков из любого типа геля после любого способа их фракционирования. Вырезанный участок геля с белковой зоной помещают в стеклянную трубку поверх слоя предварительно заполимеризованного геля, который не доходит на несколько миллиметров до нижнего конца трубки. Этот гель можно приготовить следующим образом. Сначала, как обычно, закрывают дно трубки и в нее до желаемой высоты наливают концентрированный раствор сахарозы или глицерина, на который затем аккуратно наслаивают забуференную смесь компонентов полиакриламидного геля. После полимеризации сахарозу или глицерин удаляют, дно трубки затягивают диализной мембраной, а образовавшееся между ней и гелем пространство заполняют буферным раствором. Такую трубку с находящимися в ее верхней части кусочками геля, содержащего сфокусированную при ИЭФ белковую полосу, устанавливают в аппарат для диск-электрофореза и проводят электрофорез в соответствующем буфере. Под действием электрического поля
белок выходит из кусочков геля, проходит через вновь сформированный полиакриламидный гель и собирается ъ слое буфера над диализной мембраной, откуда он может быть извлечен. Объем этого слоя буфера легко по желанию ‘изменять и таким образом регулировать в известных пределах концентрацию получаемого белкового раствора, который при описанной процедуре одновременно освобождается и от амфолитов-носи-телей.
Определенные усилия были направлены также на разработку методов 'исследования микроколичеств белков с помощью ИЭФ. Гроссбах [484, 485] разделил пикограм'мовые количества бычьего сывороточного альбумина и ,р-лактальбумина путем ИЭФ в капиллярных трубках диаметром 0,1 мм. Квентин и Нейхофф [1045] описали способ разделения в -микроге-лях изоферментов лактатдегидрогеназы. Гели, содержавшие 6,4% Г, 3,8% С, 12% сахарозы и 3,8% амфоли-на, готовили в миниатюрных колпачках объемом 5 *мкл. Сахарозу добавляли для стабилизации градиента pH в геле [311]. В микроэлектро-форетичееких методах в гелеобразующий раствор до его полимеризации обычно добавляют тритон Х-100, что облегчает извлечение гелей из капилляров по окончании фракционирования. Но при наличии амфолина тритон Х-100 уже не требуется. Оказалось также, что очень важное значение имеет концентрация персульфата аммония, которую авторы доводили в конечном растворе геля до 4,9 мг/»мл. Дальнейшее ее снижение приводит к получению механически непрочных гелей. Все экспериментальные процедуры проводили совершенно так же, как при обычном м<икроэлектрофорезе в геле. Капилляры заполняли, погружая их в гелеобразующий раствор, и устанавливали на подставку из пластилина. Поверх гелеобразующего раствора наслаивали воду, которую после полимеризации удаляли и на ее место вносили сначала ОД мкл анализируемой пробы, а затем слой 4%-ного раствора амфолина в 12%-ной сахарозе. Исследуемый раствор рекомендуется помещать на кислотной стороне геля [420, 1045] . В качестве анодного и катодного растворов использовали соответственно разбавленные серную кислоту с pH 2,95 и NaOH с pH 10,4, содержавшие 12% сахарозы. ИЭФ проводили при комнатной температуре и постоянном напряжении 200 В. После выдавливания гелей из капилляров анодный конец каждого из них помечали, погружая его на короткое время в 1%-ный раствор кумасси яркого синего. Затем гели окрашивали для выявления лактатдегидрогеназной активности. Описанным методом авторы изучали распределение изоферментов лактатдегидрогеназы в различных отделах мозга кролика, используя для каждого определения 60 мкг ткани [1045].
.Рис. 59. Сравнение градиентов pH и результатов изоэлектрического фокусирования белков в 7,5%-ном полиакриламидном геле, проведенного в макро- и микромасштабах [420]. Гели содержали амфолины фирмы LKB с pH в интервале 3—10. Кривая представляет собой градиент pH, полученный в макрогеле. Светлые кружки обозначают средние значения pH в каждом кусочке разрезанного микрогеля длиной 1 см, отложенные против расстояний от начала геля до середины каждого кусочка. Темные кружки указывают средние расстояния, пройденные стандартными белками при pH, соответствующих изоэлектри-ческим точкам. Линии, пересекающие темные кружки, отражают утроенную величину среднего стандартного отклонения. Были использованы следующие белки (в порядке увеличения расстояния, пройденного ими от старта): а-ка-зеин, яичный альбумин, бычий сывороточный альбумин, гемоглобин, химотрип-син, а-химотрипсиноген А, рибонуклеаза.
