Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Интенсивность окраски полос удается повысить выдерживанием гелей в атмосфере аммиака [1104], но эта процедура непригодна для белков с низкой молекулярной массой, по всей вероятности, из-за того, что они плохо фиксируются. Например, при такой обработке не выявляются после ИЭФ ни рибонукле-аза, «и инсулин [1104].
Модификация этого метода описана в другой работе [478]. Гели погружают на 15 мин в раствор, содержащий 0,5 г бромфенолового синего и 50 мг сулемы в 500 мл 50%-ного спирта. (Следует остерегаться попадания этого раствора на кожу!) Отмывание гелей производят в течение ночи в смеси этанол — вода — уксусная кислота (30:65:5 по объему). Отмытые гели хранят в 7,5%-ной уксусной кислоте. Этим методом выявляются также и полосы амфолина, которые окрашиваются в желтый цвет, тогда как участки между ними становятся красноватыми. Недостаток метода окрашивания белков бромфеноловым синим заключается в том, что о.н имеет более низкую чувствительность, чем методы с применением других красителей.
Для одновременного окрашивания и фиксирования белкоь предложено неоколвко смесей, содержащих кумаоси яркий си-
ний. Вестерберг [1346] выявлял положение белков в гелях после ИЭФ с помощью реактива, содержащего 75 мл метанола,. 186 мл воды, 30 г ТХУ, 9 г сульфосалициловой кислоты и ку-масси яркий синий R-250 в конечной концентрации 0,1%. Гели выдерживали в этом растворе при 60 °С. Вследствие повышения температуры увеличивалась скорость диффузии и сокращалось время окрашивания. Гели толщиной 1—2 мм окрашивали 15 мин, после чего отмывали их смесью, состоящей из 250 мл этанола, 650 мл воды и 80 мл уксусной кислоты. В течение первого часа этот раствор меняли каждые 20 мин. Такая процедура позволяла определять до 0,03 мкг яичного альбумина, 0,02 М'кг сывороточного альбумина и 0,01 мкг гемоглобина.
Для одновременного окрашивания и фиксации белков в присутствии амфолина описан еще один «коктейль», содержащий 5% ТХУ, 5% сульфосалициловой кислоты, 18% метанола и 0,02% кумасси яркого синего [1404, 1405]. Белковые полосы становятся видимыми сразу же после окрашивания этим раствором. Для снижения фона гели промывали водой или разбавленной уксусной кислотой.
Ригетти и Дрисдэйл [1093] применяли очень чувствительный метод окрашивания, обеспечивающий получение низкого фона. Гели помещали в смесь уксусная кислота — этанол — вода (10:25:65), содержащую 0,05% кумасси яркого синего и 0,1% сульфата меди (И), и инкубировали их .не менее 4 ч на качалке. Затем окрашенные гели переносили в такой же раствор, но содержащий лишь 0,01% красителя, после чего их окончательно отмывали в смеси уксусная кислота — этанол — вода (10:10 : 80).
Малик и Берри [805] использовали реактив для фиксации и окрашивания белков, приготовленный на основе химически модифицированного кумасси яркого синего. 100 мл 2%-ного раствора кумасси яркого синего R-250 смешивают с равным объемом 2 н. серной кислоты и дают отстояться образовавшемуся осадку. К надосадочной жидкости по каплям приливают 10 н. NaOH до появления голубоватого оттенка и, наконец, добавляют ТХУ до конечной концентрации 12 г/100 мл. Хроматографический анализ ггоказал, что образовавшийся краситель отличается от исходного. В гелях, помещенных в полученный раствор, белковые фракции становятся видимыми через 15 мин; в течение следующих 15 мин интенсивность окраски возрастает и затем уже не изменяется на протяжении 24 ч. Поэтому для окрашивания гелей данным методом установлено стандартное время — 30 мин, после чего гели переносят в воду, где они и хранятся. Есл'и фон начинает окрашиваться, то достаточно поместить гели на короткое время в 0,2%-ную серную кислоту, чтобы эта окраска исчезла. Однако такую обработку следует
проводить очень осторожно, так как при длительном пребывании гелей в кислоте весь краситель может полностью обесцветиться. Описанный метод обеспечивает получение очень четких полос, но обладает более низкой чувствительностью по сравнению с методом, в котором используется немодифицированный краситель.
Райзнер и др. [1073] разработали очень простую и быструю методику окрашивания, не требующую обесцвечивания фона. Она основана на том, что кумаоси яркий синий G-250 изменяет свой цвет в разбавленной хлорной кислоте и вновь приобретает исходную окраску при связывании с белками. Для приготовления окрашивающего раствора указанный краситель (конечная концентрация 0,04%) добавляют к 3,5%-ной хлорной кислоте, и эту смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч. Полученный раствор фильтруют сначала через фильтровальную бумагу ватман № 1, а затем через миллипо-ровый фильтр с размером отверстий 0,45 мкм. Реактив сохраняется при комнатной температуре неограниченно долго. Гели инкубируют в нем 2 ч при 37 °С или 4 ч при комнатной температуре, после чего их хранят в пробирках, заполненных 0,04%-ны'М раствором кумасси яркого синего G-250 в 2,5%-ной хлорной кислоте. Данный реактив позволяет избирательно выявлять гистоны с высоким содержанием аргинина, так как гистоны,. богатые лизином, растворяются в хлорной кислоте.
