Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Фрейтер [398] испытал несколько окрашивающих реактивов для непосредственной визуализации белков шерсти. Хорошие результаты удалось получить со смесью 0,05%-ных растворов кислотного прочного синего В и кумасси фиолетового R в 5%-ной уксусной кислоте. Быстрое обесцвечивание фона происходило при вымачивании гелей в 5%-<ной уксусной кислоте.
Предложен быстрый способ выявления белка в геле при условии, что на одну полосу приходится более 5 мкг белка [1092]. Гели выдерживают 30 мин при 25 °С в 0,1%-ном растворе малахитового зеленого в смеси, состоящей из 25% этанола, 10% уксусной кислоты и 65% воды. Обесцвечивание производят с помощью поперечного электрофореза в водном растворе, содержащем 10% этанола и 10% укоусной кислоты. Для повышения интенсивности окраски полос прибегают к повторной обработке гелей 0,01%-ньгм раствором кумасси яркого синего, не приводящей к усилению окраски фона.
Другой путь выявления белковых зон после ИЭФ — это сканирование гелей в ультрафиолетовом или видимом свете. Наибольшей точности удается достигнуть, по-видимому, при прямом сканировании гелей в процессе ИЭФ [215]. ИЭФ проводят в кварцевой трубке, покрытой изнутри метилцеллюлозой для предотвращения электроэндосмоса [565, 566] и присоеди-
580
0,6-
0А-
0,2-
J r\i /V /У
0-
4,0 мин 29,8 мин
/4,3 мин 51,1 тн
167 мин
ни
0 мин
Рис. 60. Расширение полученной при изоэлектрическом фокусировании зоны (миоглобин из сердца лошади) после отключения электрического тока [215]. Кривая нулевого времени получена путем сканирования в процессе ИЭФ непосредственно перед отключением напряжения, остальные кривые регистрировались через указанные промежутки времени.
нешгой к регистрирующему спектрофотометру фирмы Gilford (тип 2000). Фоновый шум снижают, применяя очищенные реактивы и полимеризуя гели в присутствии минимального количества рибофлавина. Данный вариант ИЭФ обладает более высокой разрешающей способностью, чем другие шире распространенные методы ИЭФ в геле. Как показано методом прямого сканирования, это объясняется быстрым расширением зон после отключения электрического тока [215] (рис. 60).
Определение изоэлектрических точек белков, разделенных методом изоэлектрического фокусирования в геле. Чтобы определить изоэлектрическую точку белка, необходимо измерить pH содержащего его участка геля.
Самый простой способ измерения pH — это использование микроэлектрода, который можно непосредственно наложить на поверхность геля. Надежность получаемых таким образом результатов зависит от размера электрода, чувствительности рН-метра и времени, прошедшего между окончанием ИЭФ и регистрацией pH.
При отсутствии подходящего электрода гели можно разрезать на тонкие полооки или на несколько более крупных частей и определить pH каждого участка после элюции из него амфо-литов-носителей дистиллированной водой. Обычно к гелю добавляют небольшое количество свежепрокипяченной дистиллированной воды (как правило, соответствующее 1 —1,5 объемам кусочка геля). Образцы из пластин геля удобно извлекать острым сверлом для пробок. После вымачивания гелей в течение 1—2 ч измеряют pH полученных растворов с помощью любого чувствительного рН-метра. Разумеется, при этом следует принимать необходимые меры, чтобы свести к минимуму влияние атмосферного С02.
Если величины pH устанавливают описанным методом, то нужно иметь по крайней мере два параллельных столбика геля, в которых сфокусированы образцы одного и того же белка. Один гель служит для выявления положения белка, а другой — для регистрации градиента pH. В процессе окрашивания и обесцвечивания гелей их размеры часто меняются, поэтому для получения сравнимых результатов следует принимать во внимание возможность их набухания и сжатия.
Для того чтобы избежать трудностей, связанных с набуханием и сжатием гелей, используют внутренние маркеры, которыми могут служить белки (предпочтительно окрашенные) [749, 1456], амфотерные красители [245] и амфотерные комплексы [901].
Конвэй-Жакоб и Левин [245] исследовали возможность применения красителей, изоэлектрические точки которых приведены в табл. 3. Во все трубки с гелем добавляли смесь, содержавшую по 2—5 мкг каждого индикатора. По окончании ИЭФ сразу после извлечения гелей из трубок отмечали положение маркеров, втыкая в их полосы в геле маленькие кусочки проволоки. Затем гели обрабатывали 5%-ной ТХУ, окрашивали амидовым черным и обесцвечивали 7%-ной уксусной кисло-
Таблица 3
Изоэлектрические точки амфотерных красителей, рекомендуемых для использования в качестве маркеров pH при ИЭФ в геле [245]
Наименование красителя Изоэлектрическая точка
Патентованный синий V 3,00
Малахитовый зеленый FCF 3,05 (основная полоса)
3,85 (дополнительная полоса)
Метиловый синий 3,60
Эванс голубой 5,35
Конго красный 5,80
