Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
-шаклцую способность ИЭФ, было разработано несколько ти-'пов приборов, позволяющих следить за поведением белков в процессе электрофокусирования и (или) собирать фракции из колонки с градиентом плотности без отключения напряжения.
Один из таких приборов создан фирмой ISCO (США) и схематически изображен на рис. 56. Электрическое соединение электродных сосудов с трубкой, содержащей градиент плотности, осуществляется через полупроницаемые мембраны. Разделение происходит в вертикальной колонке, к нижнему концу которой присоединен шприц, приводимый в действие электромотором. При подаче из шприца в колонку какого-либо раствора с высокой плотностью весь градиент плотности будет вытесняться вверх. Причем во время этой процедуры не обязательно отключать напряжение, так как электрический ток проходит через полупроницаемые мембраны. Средняя часть трубки одновременно служит кюветой для измерения экстинк-ции, поэтому раствор с градиентом плотности наливают в колонку только до уровня этой оптической ячейки. При движении градиента вверх положение полос, поглощающих ультрафиолетовый свет, регистрируется фотометром, связанным с самописцем. Опыты по ИЭФ в описанном приборе четко показали, что острота пиков отдельных веществ существенно не изменяется при их повторном сканировании. В настоящее время в продаже имеются приборы такого типа двух размеров. В меньшем из них (модель 210) центральная трубка изготовлена из тефлона и вмещает 8,5—13 мл градиентного раствора. В приборе большего размера (модель 630) в центре находится колонка из смеси ацетата и бутирата целлюлозы, вмещающая 100 мл раствора с градиентом плотности. Более подробные сведения об этих приборах можно найти у других авторов [24, 208—212, 464, 465].
В ряде работ содержатся детальные технические описания аппарата, а также дополнительных приставок, позволяющих наблюдать за процессом разделения путем сканирования in situ веществ, подвергающихся изоэлектричеокому фокусированию [204—206, 216]. Градиент плотности создают в кварцевой трубке, перемещающейся в вертикальном направлении с заданной скоростью при помощи синхронного электромотора. С одной стороны трубки на нее направляют световой луч из установленного на определенном уровне монохроматора, а с противоположной — измеряют и регистрируют интенсивность прошедшего через трубку света. Такое устройство дает возможность многократно сканировать колонку через различные интервалы времени в ходе изоэлектричеокого фокусирования, не опасаясь перемешивания разделенных зон. По окончании опыта содержимое колонки можно фракционировать. В упомяну-
тых выше работах обсуждается также возможность полной автоматизации всех этих процедур.
Чтобы получить больше сведений о фракционируемых молекулах и о самом процессе разделения, был разработан метод «неустановившегося изоэлекгрического фокусирования» [209— 211, 213, 217, 1396]. В нем используется кинетический прием, обеспечивающий непрерывное поступление информации о положении пика вещества и его концентрационной характеристике во время фокусирования этого вещества в электрическом поле и его дефокусирования после отключения тока. Регистрацию результатов производят с помощью сканирующего прибора, соединенного с цифровым накопителем данных. Большой объем получаемой в каждом опыте информации требует применения системы автоматической обработки данных.
Свендсен [1254] сконструировал аппарат, в котором фракционирование содержимого 'колонки с градиентом плотности осуществляется при включенном электрическом поле. В этом аппарате нижний электрод отделен от колонки полупроницаемой мембраной и расположен в специальном отсеке с подводящей и отводящей трубками, что позволяет прокачивать через него электролит из другого резервуара и таким образам удалять выделяющиеся при электролизе пузырьки газа. По окончании ИЭФ, не отключая напряжения, в 'пространство, находящееся непосредственно над полупроницаемой мембраной, насосом подают концентрированный раствор сахарозы. Одновременно вторым насосом из колонки откачивают жидкость через расположенную над мембраной выводную трубочку, причем скорость отсасывания содержимого колонки должна превышать скорость поступления раствора сахарозы. Благодаря такой разнице в производительности насосов образуется очень стабильная контактная поверхность раздела между поднимающимся снизу плотным раствором сахарозы и опускающейся сверху до уровня выводной трубки менее плотной жидкостью, заполняющей колонку. Описанная система полностью исключает перемешивание разделившихся белков, неизбежно происходящее в отсутствие электрического поля из-за наличия диффузии. Поэтому удается получить очень узкие зоны. К сожалению, pH собранных фракций сильно изменяется под влиянием раствора сахарозы, который может быть кислым или щелочным. Вследствие этого невозможно определить изоэлектрические точки выделенных белков.
Боддин и др. [144] предложили иной способ извлечения фракций из колонки с градиентом плотности без отключения электрического тока по окончании ИЭФ. Этим способом можно получать компоненты разделенной смеси, не смешивая их с кислыми или щелочными электродными растворами. Он вклю-
