Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Гайнер [420] исследовал белки в количестве 10-10—10~9 г. Он доказал, что микровариант ИЭФ имеет такую же высокую разрешающую способность, как и макровариант. При проведении опытов по разделению смеси очищенных белков он обнаружил, что как прадиент pH, так и положение полос сфокусированных белков было практически одинаковым в макро- и микрогелях одной и той же длины (рис. 59). Более 'подробно ИЭФ в микрогелях описан в книге Нейхоффа [915].
Как и в случае ИЭФ в градиенте плотности, снижение электрической проводимости при ИЭФ в геле не дает еще достаточно оснований для заключения об окончании процесса фокусирования. Чтобы определить время, необходимое для ИЭФ в геле, следует поставить предварительные опыты с применением окрашенного белка, нанесенного с обоих концов геля [1347]. В электрическом поле две полосы этого белка будут двигаться навстречу друг другу, и момент их слияния можно считать завершением фокусирования всех белков, у которых молекулярная масса не выше, чем у контрольного белка. Как правило, при работе с гелями обычных размеров увеличение продолжительности ИЭФ на 1—2 ч не сопряжено с каким-л'ибо риском, однако чрезмерного удлинения времени фокусирования следует избегать, так как образующиеся в полиакриламидном геле градиенты pH не могут долго оставаться стабильными
[231, 381]. При слишком длительном ИЭФ происходят сдвиг градиента pH и образование плато на трафике зависимости pH от расстояния в геле. Это явление носит название «феномена плато». Сдвиг в градиенте pH приводит к лучшему разделению компонентов смеси с изоэлектрическими точками, лежащими вблизи плато, и к сжатию удаленных от него полос. Время, необходимое для формирования плато, определяют экспериментальным путем. Надо подчеркнуть, что нежелательных [последствий, возникающих из-за сдвигов в градиенте pH, в большинстве случаев можно избежать, подобрав оптимальную длительность разделения в данной системе. Все эти проблемы подробно обсуждались ранее [868].
Выявление белков после ИЭФ. Как правило, белки выявляют теми же методами, которые применяются после обычного гель-электрофореза, а именно окрашиванием электрофореграмм специальными красителями, сканированием их в видимом или ультрафиолетовом свете, преципитацией белков специфическими антигенами, а в случае фракций, обладающих ферментативной активностью, получением энзимограмм.
Окрашивание белков специфическими красителями осложняется при ИЭФ из-за присутствия амфолина, так как большинство таких красителей образует комплексы и с амфолита-ми-носителями. Поэтому необходимо использовать особые приемы окрашивания.
Был предложен очень простой способ визуализации белков после ИЭФ [1456]. Сразу же после извлечения из трубок гели погружают в 5%-ный раствор ТХУ. Зоны с высоким содержанием белка, выявляющиеся вскоре в виде полупрозрачного осадка, можно сфотографировать на темном фоне.
Хотя концентрация белков в зонах, разделившихся при ИЭФ в геле, и достигает значительного уровня, он не всегда достаточно высок для обнаружения белков путем их осаждения. Поэтому в большинстве случаев приходится прибегать к более чувствительным методам окрашивания. Для преодоления трудностей, связанных с взаимодействием красителя и амфолина, имеются два пути. Первый путь — это удаление амфолитов-носителей после фиксации, но до окрашивания белков, а второй — подбор таких условий, при которых комплексы краситель — амфолин оказываются менее прочными, чем комплексы краситель — белок. Ниже будут рассмотрены некоторые приемы, позволяющие попользовать обе эти возможности.
После фиксации белков с помощью ТХУ или сульфосали-циловой кислоты амфолиты-носители можно удалить, повторно промывая гели в тех же растворах. Однако такой способ представляет собой длительную процедуру из-за низкой скорости диффузии. Для экономии времени целесообразно прибегнуть к
электрофоретическим методам удаления амфолина. К ним относятся способ, описанный Дэвисом [281], и метод «поперечного электрофореза», предложенный Швабе [1151]. Оба они подробно описаны в разд. 1.15.2. Белки, оовобожденные от ам-фолитов-носителей, окрашивают любым способом, обычно применяемым после гель-электрофореза, например погружая гели в 0,1 — 1%-ный раствор амилового черного в 7%-ной уксусной кислоте. От избытка красителя можно избавиться многократным промыванием гелей в уксусной кислоте или с помощью электрофореза. Другая группа методических приемов позволяет окрашивать гели без предварительного удаления амфолитов-носителей.
Описан метод [69], согласно которому гели сразу же после ИЭФ погружают в 0,2%-ный раствор бромфенолового синего в смеси этанол — вода — уисуоная кислота (50:45:5 по объему) . Для развития окраски достаточно одного часа, но и более длительное выдерживание гелей в окрашивающем растворе не причиняет никакого вреда, за исключением того, что высокая концентрация этанола может вызвать дегидратацию и сморщивание геля. Большое значение имеет концентрация спирта, так как ее снижение приводит к образованию осадка на поверхности геля. После окрашивания гелей избыток красителя отмывают в смеси этанол — вода — уксусная кислота (30 : 65 : 5 по объему), однако не следует слишком сильно обесцвечивать фон, так как при этом могут стать менее яркими и зеленые полосы белка.
