Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Рис. 57. Прибор для изоэлектрофокусирования, приспособленный для элюции градиента плотности в электрическом поле [144]. А. Прибор. Б. Принцип элюции. 1— сосуд для основания (кислоты); 2 — полиэтиленовая трубка; 3— верхняя отводная трубка для элюата; 4 — скользящая пробка; 5 — верхняя кольцевая муфта; 6 — заглушка для элюата; 7 — электродный сосуд; 8—сосуд для кислоты (основания); 9 — насос; 10 — нижняя отводная трубка для элюата; 11 — отводная трубка; 12 — насос для элюата; 13 — коллектор фракций; 14 — градиентный смеситель; 15 — мембрана; 16 — градиент плотности сахарозы, содержащий амфолиты-носители и белок.
чает в себя все преимущества процедуры Свендсена [1254] и, кроме того, позволяет непосредственно измерять изоэлектри-чеокие точки выделенных молекул. Принцип элюции ло этому методу показан на рис. 57. В изображенном приборе электроды находятся в боковых трубках и отделены полупроницаемыми мембранами. В нижнем электродном сосуде обеспечивается циркуляция электролита для удаления пузырьков газа. Выводная трубка расположена в дне градиентной колонки. По окон-
. Основание - Кислота
Рис. 58. Принцип устройства прибора для непрерывного изоэлектрического фокусирования в градиенте плотности [365]. Показан вертикальный разрез разделительной кюветы. 54 трубки (изображено лишь 12 из них), расположенные с левой стороны кюветы, вводят в нее градиентные растворы сахарозы, и такое же число трубок с правой стороны выводят из нее полученные фракции. Электродный раствор с высокой плотностью, отделенный от градиентного раствора полупроницаемой мембраной, протекает по дну кюветы. Он образует на электроде, расположенном в трубке Т, слой, проводящий электрический ток.
чании фокусирования открывают элюционный клапан и откачивают градиент, давая верхнему электролиту заполнить освободившееся пространство. При этом 'напряжение постепенно снижают, чтобы избежать чрезмерного возрастания силы тока.
В ряде работ описаны очень быстрые микрометоды ИЭФ, пригодные для разделения ©сего лишь 100 мкг белка в стандартных кварцевых кюветах, содержащих 1,5 мл раствора с градиентом плотности [401—404, 643, 1097]. Такие микрометоды позволяют проводить прямое спектрофотометрическое выявление и исследование отдельных белков.
В некоторых случаях возникает необходимость использовать ИЭФ для фракционирования больших количеств веществ. Для этой цели разработана методика непрерывного проточного изоэлектрического фокусирования в градиенте плотности [365] с применением аппарата, обладающего практически неограниченной емкостью. Принцип работы такого аппарата схематически представлен на рис. 58. ИЭФ проводят в прямоугольной ячейке, образованной двумя параллельными стеклянными пластинами, установленными вертикально на расстоянии 0,3 см друг от друга. С одной стороны ib пространство между стеклами подают растворы, содержащие 1, 2, 3. ..50% сахарозы и смесь амфолитов-носителей, используя для этого 50 каналов 108-канального перистальтического насоса. Катод, расположенный в верхней части ячейки, находится в непосредственном контакте с щелочным раствором, прокачиваемым через четыре верхние трубки. Анод помещен в вертикальный сосуд, отделенный от градиента плотности полупроницаемой мембраной. Рас-
твор кислоты поступает к нему через несколько нижних входных трубок под действием того же самого 108-канального перистальтического насоса. Исследуемую пробу обычно смешивают с одним из растворов, используемых для формирования градиента плотности. Каждый из сфокусированных белков выходит из кюветы с потоком слоя градиента плотности с соответствующим, pH. Описанный метод обладает хорошей воспроизводимостью и высокой разрешающей способностью, а его емкость зависит только от продолжительности опыта.
Другой тип приборов для ИЭФ в градиенте плотности позволяет преодолеть трудности, связанные с выделением пузырьков газа на электродах. Для этого в нижней части колонки помещают электрод, изготовленный из такого материала, на котором не образуются пузырьки. Рилбе [1097] использовал для ИЭФ в градиенте плотности цилиндрическую колонку диаметром 60 мм, вставленную в трубку, в которой циркулировала охлажденная вода. Электроды были расположены на расстоянии 38 мм друг от друга, причем верхний представлял собой платиновую сетку, а нижний, служивший катодом, — пластинку из сплава серебра с палладием, содержавшего 25% серебра. Водород, образующийся на катоде в процессе электролиза, остается внутри палладиевого сплава [909]. При начальном напряжении 55 В и силе тока 100 мА ИЭФ (в таком аппарате проходит всего за 1 ч. Еще один час требуется для 'последующего фракционирования градиента; таким образом, весь опыт занимает относительно мало времени.
В аналогичном приборе для работы с меньшими объемами [1097] расстояние между электродами составляло 1 ом, а площадь поперечного сечения равнялась 10 см2.
Методику проведения изоэлектрического фокусирования в кювете от спектрофотометра [643] также удалось модифицировать, поместив на дно кюветы электрод, не выделяющий газа [403, 404].
