Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Гааль Э. -> "Электрофорез в разделении биологических макромолекул" -> 49

Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.

Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул — М.: Мир, 1982. — 448 c.
Скачать (прямая ссылка): elektroforezvrazdeleniibiologicheskih1982.djvu
Предыдущая << 1 .. 43 44 45 46 47 48 < 49 > 50 51 52 53 54 55 .. 185 >> Следующая

Кох и Бакс [689] сконструировали U-образный прибор для изоэлектрофокусирования малых количеств белка в градиенте плотности. Этот прибор (рис. 54) состоит из двух трубок, одна из которых покрыта для устранения электроэндосмоса попе-
Рис. 54. Прибор для изоэлек-трического фокусирования в градиенте плотности малых количеств белка [689]. / — трубка с градиентом плотности; 2 — платиновые» электроды; 3 — резервуар для электролита с высокой плотностью; 4 — трубка из силиконовой резины. Прибор укрепляется в плексигласовой рамке, не изображенной на рисунке, с помощью держателей (5).
речно сшитой формальдегидом метилцеллюлозой. В ней формируют градиент плотности либо вручную, либо «полуавтоматически» (т. е. растворы, предназначенные для последующего наслаивания в колонке, готовят с помощью градиентного смесителя и коллектора фракций). Другое колено U-образной трубки служит резервуаром для электролита с высокой плотностью. Обе стеклянные трубки соединяются между собой шлангам из силиконовой резины. Всю U-образную конструкцию укрепляют на плексигласовой рамке и >в каждое колено вставляют платиновую проволоку, выполняющую роль электрода. По окончании фокусирования прибор помещают в морозильник, затем трубки разъединяют, замороженное содержимое колонки извлекают из нее и разрезают на цилиндрические столбики, в которых определяют pH и содержание белка любым пригодным для этого методом.
Уэллер и др. [1402] предложили иную конструкцию U-об-разного аппарата, позволяющего разделять менее 5 мг белков в градиенте плотности объемом 11 мл.
Годсон [444] использовал для ИЭФ в градиенте -плотности трубки с припаянными боковыми отводами (рис. 55). Такие J-образные трубки помещают в стандартный прибор для диск-электрофореза. Верхнюю часть трубки, содержащую градиент плотности, вставляют, как обычно, в верхний электродный сосуд, а боковой отросток, заполненный этилендиамином и 50%-ным раствором сахарозы, погружают в нижний электродный сосуд. После завершения ИЭФ в колонку снизу накачивают насосом раствор с высокой плотностью, вследствие чего -весь градиент плотности поднимается вверх и вытесняется сначала в анализатор (фирма ISCO, США), а затем ,в коллектор фракций. Описанное устройство позволяет разделять 0,1 — 1 мг белков в градиенте объемом 10 мл. Помимо простоты конструкции еще одно важное преимущество данного прибора состоит в том, что он дает возможность исследовать одновременно несколько образцов при идентичных условиях.
Был описан еще один очень простой метод ИЭФ [709]. Стеклянные трубки с внутренним диаметром 0,6 см и длиной 20 см закрывают снизу диализной мембраной, заполняют раствором с градиентом концентрации сахарозы (40—10%), содержащим 1% амфолина, и помещают в аппарат для диск-электрофореза. Фокусирование заканчивается через 5—6 ч, после чего на верхнюю часть каждой трубки надевают конический тефлоновый колпачок, через который полученные фракции вытесняются вверх в результате накачивания в трубку снизу какого-либо раствора с высокой плотностью. Естественно, что при использовании такой методики также можно одновременно изучать несколько различных препаратов.
Рис. 55. Аппарат J-образной формы для одновременного изоэлектрического фокусирования нескольких образцов [444]. А. Размеры трубок и приспособление, для фракционирования раствора с градиентом плотности после изоэлектрического фокусирования. Масштаб: 5 мм = 1 см. Б. Расположение J-образных трубок во время опыта. 1— трубочка с канюлей, соединяющая колонку с анализатором градиента плотности фирмы ISCO; 2—съемная воронка для собирания фракций; 3 — пришлифованные поверхности; 4 — анодный раствор с низкой плотностью; 5 — электролит (H2SO4); 6 — катодный раствор с высокой плотностью; 7 — стержень для перемешивания жидкости на магнитной мешалке; 8 —верхний электродный сосуд; 9 — градиент плотности с амфолинами;
10 — нижний электродный сосуд.
Изоэлектрическое фокусирование белковых смесей обеспечивает получение очень узких зон, но высокая концентрация белков в этих зонах приводит к тому, что их диффузия происходит с большой скоростью. Во время ИЭФ неблагоприятному влиянию диффузии противодействует электрическое поле. Однако в описанных выше методиках электрический ток выключают перед началом собирания фракций, что представляет собой довольно длительный процесс, в течение которого узкие полосы сфокусированного белка могут расшириться. А это означает, что действительное разделение, полученное в опыте по ИЭФ в градиенте плотности, хуже, чем достигнутое на его первом этапе. Для того чтобы использовать высокую разре-
Рис. 56. Схематическое изображение колонки для электрофореза в градиенте плотности (фирма ISCO; модель 210) [464, 465]. Упрощенный вариант, который можно использовать также и для изоэлектрофокусирования. 1 — съемная крышечка для введения градиентного раствора и образца; 2— выходная трубка для охлаждающей жидкости; 3 — шкала в сантиметрах; 4 — полупроницаемые мембраны; 5 — верхние электродные сосуды; 6 — центральная тефлоновая трубка (внутренний диаметр 1 см); 7—кварцевые окошки; 8 — измеритель УФ-света; 9 — трубка для охлаждающей жидкости; 10—нижние электродные сосуды; 11 —шприц, приводимый в движение электромотором*; 12 — входная трубка для охлаждающей жидкости; 13 — электрод; /4 —градиентная колонка; 15 — охлаждающая рубашка; 16 — прозрачная центральная трубка; 17 — трубка к коллектору фракций.
Предыдущая << 1 .. 43 44 45 46 47 48 < 49 > 50 51 52 53 54 55 .. 185 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed