Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Наслаивать воду на раствор мономеров следует с максимальной осторожностью, чтобы не происходило разбавления раствора акриламида. Лёнинг [777] предлагает наслаивать на раствор мономеров гептан или легкую фракцию петролейного эфира. Петри i[999] применяет для этой цели 1-октадекан, содержащий 2,6-ди-ту?ег-бутил-4-метилфенол. Такой раствор не смешивается с водой, а производное фенола эффективно связывает молекулярный кислород. Исходный раствор следует хранить в атмосфере азота.
Ричардс и Леканиду 1[1086] предложили использовать устройство для получения четкой границы между гелеобразующим раствором и буфером, аналогичное тому, которое было описано Каном и Полсоном [650]. Трубки для геля заполняют гелеобразующим раствором до уровня, расположенного на 1 см выше требуемого. Сверху наслаивают обычным путем буфер* не слишком заботясь о том, чтобы избежать перемешивания. Затем в трубку вводят иглу для подкожных инъекций, опуская ее на определенное расстояние от верхнего края трубки, и с помощью шприца осторожно удаляют из трубки жидкость. Та-
кой способ позволяет получать очень четкую границу раздела между раствором мономеров и буфером.
Для предотвращения возможного перемешивания растворов во время наслаивания буфера Флинт и Харрингтон использовали пробку, образующую границу раздела между двумя растворами [387]. Трубки для геля вставляют в резиновые крышки от флаконов с сывороткой и заполняют гелеобразующим растворов до уровня, находящегося на 3 см ниже верхнего края трубки. Затем на дно трубки опускают плексигласовую пробку для создания границы раздела. К открытому концу трубки присоединяют кусок тайгонового шланга и добавляют раствор мономеров до уровня, находящегося выше верхнего края трубки. После окончания полимеризации трубки вынимают из резиновых крышек и отделяют от шланга. Выступающие концы геля обрезают вровень с верхним краем трубок и с противоположного конца удаляют пинцетом плексигласовые пробки. # Тонкую пленку геля, образовавшуюся между пробкой и внутренней поверхностью трубки, также удаляют. Таким образом в каждой трубке получается ровная однородная поверхность геля.
Работа с мягкими гелями, используемыми для электрофореза высокомолекулярных нуклеиновых кислот, требует большой осторожности. При переносе таких гелей пинцетом можно повредить их. Лучше всего для этой цели всасывать гели в плексигласовые трубки и затем выдувать их оттуда в соответствующий сосуд {777].
Для электрофореза нуклеиновых кислот в гелях используют несколько буферных систем. Лёнинг [777] применял буфер, содержащий 0,04 М трис, 0,02 М ацетата натрия и 2 мМ ЭДТА (pH 7,8; 5°С). Добавление хелатобразующих агентов, например ЭДТА или пирофосфата, предотвращает адсорбцию РНК на поверхности геля. ЭДТА способствует также формированию четких зон. Буферная система, часто обозначаемая в литературе как «буфер Е» {778], содержит 36 мМ трис, 30 мМ NaH2P04 и 1 мМ ЭДТА. При комнатной температуре такой буфер имеет pH 7,7. Лёнинг [778] использовал также буфер (буфер «low salt») с низким содержанием солей (30 мМ трис, 16 мМ НС1, ОД мМ ЭДТА, pH 8,1).
Для электрофоретического разделения нуклеиновых кислот применяют также неоднородные буферные системы [387, 1087]. При электрофорезе в комбинированном полиакриламидно-агарозном геле применяли трис-боратный буфер [983]. Электрофоретические свойства нуклеиновых кислот, а значит, и их разрешение при электрофорезе в какой-то степени зависят от используемой буферной системы [778, 1004, 1070]. По нашему мнению, в каждом конкретном случае наиболее подходящий буфер
Рис. Ив. Зависимость ширины электрофоретической зоны от нанесенного на гель количества РНК [1086]. По оси ординат отложены квадраты ширины зоны, а по оси абсцисс — количество ренатурированной 5S-PHK в образце. Объем образца во всех случаях составлял 60 мкл. Электрофорез проводили в 12,5%-ном полиакриламидном геле при плотности тока 0,0283 А/см2 в течение 120 мин.
Рис. 117. Зависимость между скоростью расширения зоны и количеством РНК, нанесенной на гель [1086]. Электрофорез проводили в 12,5%-ном полиакриламидном геле при плотности тока 0,0283 А/см2 в течение указанных периодов времени. На верхней и нижней кривых представлены результаты электрофореза при нанесении соответственно 6,1 и 0,9 мкг ренатурированной 5S-PHK*
можно подобрать только экспериментальным путем, поскольку на разделение макромолекул влияют как состав, так и концентрация буферных растворов.
В некоторых случаях к образцам или в разделяющий и электродные буферы добавляют ДСН. Цель добавления этого детергента состоит в том, чтобы подавить действие рибонуклеа-зы и вызвать диссоциацию рибонуклеопротеидов, которые могут присутствовать в образце. Кроме того, ДСН позволяет предотвращать возникновение некоторых артефактов [734],
ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
Для объяснения поведения низкомолекулярных РНК при электрофорезе Ричардс и Леканиду i[1086] разработали «полуколи-чественную теорию», которая была подтверждена ими экспериментальным путем. В настоящем разделе мы рассмотрим некоторые результаты, полученные в этой работе, не вдаваясь в детальное обсуждение теоретических положений.
