Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Гааль Э. -> "Электрофорез в разделении биологических макромолекул" -> 143

Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.

Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул — М.: Мир, 1982. — 448 c.
Скачать (прямая ссылка): elektroforezvrazdeleniibiologicheskih1982.djvu
Предыдущая << 1 .. 137 138 139 140 141 142 < 143 > 144 145 146 147 148 149 .. 185 >> Следующая

Из-за сложности манипулирования с мягкими гелями большинство исследователей предпочитает окрашивать липопротеи-ды перед электрофорезом (предварительное окрашивание). С этой целью краситель включают в стартовый гель или смешивают с образцом и перед электрофорезом центрифугируют [1066, 1445]. Недостаток методов предварительного окрашивания состоит в том, что они не позволяют достаточно надежно определять хиломикроны. Стартовый гель может окрашиваться избытком красителя, не связанного с липопротеидами, в результате чего создается ложное впечатление присутствия на электрофореграмме хиломикронов [373, 1445]. Чтобы облегчить визуальное обнаружение хиломикронов, Наито и др. [899] рекомендуют использовать для предварительного окрашивания разбавленный раствор суданового черного в этиленгликоле и одновременно снижать концентрацию рибофлавина в стартовом и концентрирующем гелях. Маскет и др. [830] предотвратили появление ложных зон хиломикронов, применив раствор суда-нового черного В в водном растворе диэтиленгликоля. Для поддержания красителя в растворенном состоянии они добавляли небольшое количество твина 20. Новый подход к предваритель-
ному окрашиванию липопротеидов представляет использование нитротетразолиевого голубого [1162]. В этой методике не применяется никаких органических растворителей.
11.7.8. Белки спинномозговой жидкости
Белковый состав спинномозговой жидкости человека является предметом интенсивных исследований, так как имеет большую диагностическую ценность. Спинномозговую жидкость (СМЖ) получают обычно путем люмбальной пункции, поэтому большинство литературных данных относится к люмбальной СМЖ- По белковому составу вентрикулярная и цистерналь-ная СМЖ несколько отличаются от люмбальной [1149]. В норме в люмбальной СМЖ содержится 5—65 мг белков на 100 мл. Хотя при различных заболеваниях концентрация белков в СМЖ повышается, все равно она остается слишком низкой, чтобы ее можно было определять обычными электрофоретическими методами. Поэтому перед анализом образцы белков необходимо в значительной степени сконцентрировать. Описано множество способов такого концентрирования, основанных на диализе образцов СМЖ против концентрированных растворов полимеров, удалении из них жидкости в результате впитывания ее в сухие гели (сефадекса или полиакриламида), ультрафильтрации под вакуумом через коллодиевые мешочки, диализные трубки или полые волокна, ультрафильтрации под давлением через мембраны с соответствующим размером пор или на лио-филизации. Клайне и др. [686] сравнили выход нескольких белков после концентрирования люмбальной СМЖ методами вакуумной ультрафильтрации и лиофилизации. Хотя суммарный выход белков при использовании указанных методов составлял соответственно 96 и 88%, тем не менее наблюдались существенные потери иммуноглобулинов. По данным Клайне и Штроха [685], ультрафильтрация СМЖ приводит к потере преальбуминов и изменению электрофоретической подвижности Р- и 7-глобулинов, что обусловлено, вероятно, их агрегацией. Эти данные свидетельствуют о том, что при анализе низкомолекулярных белков необходимо подбирать мембраны с достаточно мелкими порами. С другой стороны, применение мелкопористых мембран вызывает необходимость увеличивать время ультрафильтрации, что в свою очередь повышает опасность агрегации других белков, в частности иммуноглобулинов.
Большинство белковых компонентов СМЖ обнаруживается также и в сыворотке крови, однако далеко не все белки сыворотки встречаются в СМЖ, причем она особенно бедна высокомолекулярными белками. Так, например, гаптоглобин постоянно присутствует в СМЖ индивидуумов с фенотипом Нр 1—1,
mo у индивидуумов с фенотипами Нр 2—1 и Нр 2—2 его концентрация может быть слишком мала для обнаружения. Объясняется это отсутствием зон, соответствующих высокой степени полимеризации гаптоглобинов с фенотипами Нр 2—1 и Нр 2—2. ЛНП в норме в СМЖ не встречаются. Характерной особенностью белкового состава СМЖ является относительно высокое содержание преальбумина. Иммунологически этот преальбумин идентичен обогащенному триптофаном преальбу-мину плазмы крови [665]. В СМЖ найдена также добавочная зона трансферрина, обладающая меньшей подвижностью по сравнению с трансферрином С. От трансферрина сыворотки эта зона отличается только по углеводному составу [1149]. С катодной стороны к зоне 7-глобулинов примыкает отдельная зона, соответствующая так называемому следовому у-глобулину. Этот белок не связан с иммуноглобулинами. По изменению белкового состава СМЖ можно обнаруживать различные виды патологии центражной нервной системы [735, 737]. Некоторые заболевания сопровождаются избирательным повышением содержания IgG, причем это повышение имеет обычно олигоклональный характер [771].
Для электрофореза белков СМЖ применяют в основном те же методы, что и для разделения белков плазмы крови. Чтобы получить общую картину белков, содержащихся в СМЖ, можно использовать электрофорез на ацетате целлюлозы, в агаровом или агарозном геле. Вернер [1408] сочетал определение суммарного белка с электрофорезом белков. Образцы СМЖ подвергали ультрафильтрации под давлением азота и рассчитывали содержание белка по разности величин оптической плотности, измеренной при 210 нм в исходной жидкости и ультрафильтрате. Белковый концентрат собирали с ультрафильтра с помощью капилляра и подвергали его электрофорезу в агарозном геле или на ацетате целлюлозы, используя микрометод, разработанный фирмой Beckman (методика «Microzone»). В агарозном геле разрешение было несколько выше. Линк [772] изучал разделение белков, мигрирующих в область 7-глобулинов. Он отметил, что появление дискретных зон 7-глобулинов зависит от нанесенного количества 7-глобулинов. Некоторые зоны могут оказаться замаскированными при нанесении слишком больших или слишком малых количеств белка. Для установления олигоклональной природы IgG наиболее надежным методом является электрофорез концентрированных образцов СМЖ в агарозном геле (рис. 114). Некоторые исследователи пытались разработать электрофоретический метод, исключающий необходимость предварительного концентрирования образцов. Шервин [1181] использовал микроэлектрофорез на ацетате целлюлозы и высокочувствительное окрашивание белков нигрози-
Предыдущая << 1 .. 137 138 139 140 141 142 < 143 > 144 145 146 147 148 149 .. 185 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed