Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Разрешающая способность электрофореза в комбинированных полиакриламидно-агарозных гелях повышается при включении в гель 6 М мочевины [389]. В этом случае можно выявить молекулы, различающиеся по размерам всего на 5%.
Ш.1.4. Особые проблемы, возникающие
при электрофоретическом разделении нуклеиновых кислот
В методическом отношении электрофорез нуклеиновых кислот проводят почти так же, как электрофорез белков, используя в равной мере как столбики, так и пластины геля. Выше уже обсуждались проблемы, связанные с приготовлением разбавленных гелей и работой с ними. Еще одна специфическая особен-
ность электрофореза нуклеиновых кислот заключается в необходимости использовать разбавленные буферы и проводить длительное разделение. Чтобы компенсировать изменения pH в буферных растворах, можно, например, осуществлять рециркуляцию электролитов в электродных резервуарах. Однако такой метод применим лишь в том случае, если из геля удалены даже следы катализаторов либо путем промывания, либо с помощью предварительного электрофореза.
Для этой же цели используют также обратимые электроды [1009, 1086]. Такие электроды легко изготовить, и их применение можно настоятельно рекомендовать, особенно в тех случаях, когда электрофорез проводится в неводной среде. Пиндар и др. [1009] описали устройство обратимого каломельного электрода. Кроме того, применяют обратимый серебряный электрод [1199].
111.1.5. Изоэлектрофокусирование нуклеиновых кислот
Хотя ИЭФ широко используется при фракционировании белков, известно всего несколько попыток применить эту методику для разделения олигонуклеотидов и транспортных РНК [316, 1092, 1169]. Препарат N-формилметионил-тРНК, чистота которого, судя по данным хроматографии и его способности к ами-ноацилированию, составляла 97%, при ИЭФ в полиакриламидном геле с диапазоном pH 3,5-4,5 разделялся по меньшей мере на восемь компонентов. Принцип, лежащий в основе такого разделения, не очень ясен, но можно предположить, что каждая разделенная зона содержит молекулы, находящиеся в какой-то одной определенной конформации.
111.1.6. Обнаружение нуклеиновых кислот после электрофореза
Нуклеиновые кислоты интенсивно поглощают ультрафиолетовый свет, поэтому их можно обнаружить с помощью фотографирования или сканирования в УФ-свете (см. разд. 1.15.1).
Нередко для локализации полос или пятен разделенных нуклеиновых кислот используют специфические красители. Чаще всего для этой цели применяют акридиновый оранжевый (С. 1.46005), пиронин Y, или G (С. 1.45005), метиленовый синий (С. 1.52015), толуидиновый синий 0 (С.1.52040) и «стэйнзол».
По методу Ричардса и др. [1087], гели погружают в раствор красителя-фиксатора., содержащий 1% ацетата лантана, 2% акридинового оранжевого и 15% уксусной кислоты. Обесцвечивание проводят путем повторного промывания гелей водой
или с помощью электрофореза. При денситометрии различных количеств транспортных РНК, нанесенных на гель, получают пики, площади которых пропорциональны количеству РНК. Таким образом, описанный метод окрашивания позволяет определять количество РНК, присутствующей в отдельных электрофоретических зонах.
Перед, электрофорезом можно также добавлять к образцу небольшое количество акридинового оранжевого и по флуоресценции в УФ-свете обнаруживать наиболее интенсивные зоны [857].
Пиронин Y, или G (Y — от англ. yellow, a G — от нем. gelb, что значит желтый), применяют в виде 1%-ного раствора в 15%-ной уксусной кислоте. Рекомендуемое время окрашивания составляет около 4 ч [1086]. Избыток красителя удаляют путем электрофореза или повторного промывания геля разбавленной уксусной кислотой. Этот краситель дает стойкое окрашивание, поэтому электрофореграммы сохраняются в течение нескольких недель без изменения интенсивности окраски. Пиронин Y можно добавлять к образцам перед проведением электрофореза, что позволяет наблюдать за миграцией окрашенных зон в процессе электрофореза; не связанный с нуклеиновой кислотой краситель мигрирует при этом с фронтом буфера [486]. Катон и Гольдштейн [199] окрашивали нуклеиновые кислоты раствором, содержавшим 1% пиронина Y, 2% алюмохрома и 15% уксусной кислоты. Гели окрашивали в течение ночи и затем обесцвечивали с помощью электрофореза.
Пикок и Дингман [983] использовали в качестве красителя метиленовый синий, растворенный в ацетатном буфере (pH 4,7) в конечной концентрации 0,2%. После электрофореза комбинированные полиакриламидно-агарозные гели вымачивали 10— 15 мин в растворе уксусной кислоты и затем окрашивали. Обесцвечивание гелей проводили путем их промывания в нескольких сменах воды или проточной водой. На этом этапе следует проявлять осторожность, так как при длительном обесцвечивании краситель вымывается и из зон нуклеиновых кислот. Гели, окрашенные метиленовым синим, можно хранить в течение нескольких месяцев в герметичной упаковке из полиэтилептере-фталатной пленки saran wrap [1232].
Пикок и Дингман [983] сравнили несколько основных красителей. Они обнаружили, что толуидиновый синий О, тионин и азур А не менее пригодны для окрашивания нуклеиновых кислот, чем метиленовый синий, который обычно использовали эти авторы. Окрашивание пиронином Y, акридиновым оранжевым, алциановым голубым 8 GX, метиловым зеленым и галло-цианином в применявшихся авторами условиях давало менее удовлетворительные результаты.
