Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Для электрофоретического разделения нуклеиновых кислот с успехом применяются крахмальные, агаровые, агарозные и полиакриламидные гели, а также полиакриламидные гели, содержащие агарозу. По электрофорезу РНК [105] и ДНК [387] в крахмальном геле имеется сравнительно мало работ. Электрофорез в других поддерживающих средах дает более высокое разрешение. Ричардс и Леканиду [1086] пришли к заключению, что методом электрофореза в полиакриламидном геле можно разделить смесь полинуклеотидов, имеющих мол. массу менее 10 000 и различающихся по длине всего на один нуклеотидный остаток. Рубину [1117] удалось разделить 4S-, 5S- и 5,8S-PHK. Филлипс и Тимко [1004] описали разделение 5S-PHK на два компонента. Определяя степень разрешения, которую можно достигнуть при электрофоретическом разделении РНК, они сделали вывод, что для молекул РНК, имеющих константы седиментации между 22 и 45S, степень разрешения составляет две единицы S; в случае двух параллельных проб ошибка определения будет равна 5%. При шести повторных определениях степень разрешения составляет одну единицу S даже для более мелких молекул. Эти примеры свидетельствуют о том, что методы электрофореза в гелях дают превосходное разрешение при фракционировании нуклеиновых кислот.
III.1.1. Электрофорез нуклеиновых кислот в агаровом и агарозном гелях
Агаровые и агарозные гели обладают свойствами молекулярного сита, что позволяет применять их в качестве поддерживающей среды при электрофоретическом разделении высокомолекулярных нуклеиновых кислот. Для этой цели используют агаровые гели с концентрацией 1,25—2,5% [72, 824, 927,
1303, 1305, 1306]. При электрофорезе в этих гелях часто применяют фосфат-цитратный буфер с pH 8,0 или натрий-фосфат-ный буфер с pH 6,0.
Подвижность фракций рибосомной и транспортной РНК не зависит от нанесенного количества РНК в широком диапазоне
тех количеств, которые обычно используются при электрофорезе в гелях [1308]. Однако при электрофорезе микроколичеств радиоактивных нуклеиновых кислот их подвижность зависит от того, какое количество нуклеиновых кислот наносится на гель [1225]. Этот факт указывает на взаимодействие нуклеиновых кислот с носителем.
Наряду с агаровыми гелями в качестве поддерживающей среды прц электрофорезе нуклеиновых кислот используют и агарозные гели. Мак-Индоу и Манро [852] нашли, что в 2%-ном агарозном геле нуклеиновые кислоты разделяются главным образом в соответствии с их молекулярной массой. Проведение электрофоретического разделения нуклеиновых кислот в различных буферах, включая трис-ацетат, трис-фосфат и трис-НС1 [533—535], показало, что на их разделение помимо молекулярной массы влияют и другие факторы. Одноцепочечные молекулы ДНК с мол. массой от 1,2 млн. до 40 млн. можно разделять в 0,6%-ном агарозном геле при условии, что разница в молекулярной массе между молекулами составляет не менее 5%. Подвижность двухцепочечных молекул ДНК почти не зависит от их молекулярной массы. С помощью электрофореза в агарозном геле можно также разделять комплементарные цепи ДНК бактериофагов [535].
Описан простой метод отделения линейных ДНК от открытых кольцевых |[286]. Перед полимеризацией геля препарат ДНК смешивают с раствором агарозы. В процессе гелеобра-зования кольцевые молекулы захватываются гелем, тогда как линейные молекулы остаются свободными и могут быть затем выделены путем электрофореза.
После электрофореза в агарозном геле, так же как после электрофореза в других гелях, разделенные компоненты обнаруживают путем окрашивания различными красителями или методами денситометрии в УФ-свете. Поскольку высушивание агаровых гелей не представляет трудности, в УФ-свете можно получать контактные отпечатки с высушенных пленок геля.
III.1.2. Электрофорез нуклеиновых кислот в полиакриламидных гелях
В качестве среды для электрофореза нуклеиновых кислот чаще всего используют полиакриламидный гель. Размер пор полиакриламидного геля, а следовательно, и его свойства как молекулярного сита варьируют в широком диапазоне, благодаря чему в этой среде можно разделять .нуклеиновые кислоты различной молекулярной массы. Так, например, в гелях, содержащих 2—3% Т, разделяют рибосомные РНК (мол. масса 0,5-106—2 * 106); в гелях с Г, составляющим около 10%, — транс-
портные РНК (мол. масса 2,5* 104), а в более концентрирован* ных гелях — фрагменты нуклеиновых кислот, имеющих еще меньшие размеры. При использовании непрерывных или ступенчатых градиентов концентрации геля можно за один раз разделить все виды клеточных РНК. Еще одним достоинством полиакриламидного геля является возможность его применения в неводных средах, например в формамиде.
С методической точки зрения электрофорез нуклеиновых кислот в полиакриламидном геле проводят так же, как электрофорез белков. При этом можно использовать как столбики, так и пластины геля.
Определенные трудности возникают в процессе приготовления и работы с гелями, имеющими низкую концентрацию акриламида. Разбавленные гели полиакриламида способны настолько прочно связываться со стеклянными стенками, что их невозможно извлечь без повреждений. Поэтому рекомендуется использовать пластмассовые трубки (из плексигласа или пер* спекса) [777]. В этом случае приходится применять приспособление, поддерживающее гель снизу, для предотвращения его выскальзывания из трубки. С этой целью перед заполнением трубки гелеобразующим раствором ее нижнее отверстие закрывают кружками фильтровальной бумаги, ацетата целлюлозы, нитроцеллюлозного фильтра или полупроницаемой мембраны с помощью резинового или пластмассового кольца, надетого на нижний конец трубки. Таким образом обеспечивается электропроводимость. Можно также применять пробку из более концентрированного полиакриламидного геля.
