Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Описанные выше методы имеют одно существенное ограничение: в геле данной концентрации можно разделять лишь те нуклеиновые кислоты, молекулярная масса которых попадает в определенный узкий интервал. Для преодоления этой сложности Гроссбах и Вейнштейн [486] предложили использовать ступенчатый градиент концентрации полиакриламидного геля. РНК с низкими молекулярными массами проходили через верхний слой геля (2,5% Т) и разделялись в нижнем слое (7% Т), тогда как более крупные молекулы разделялись в верхнем слое геля. Для одновременного разделения 28S-, 18S-, 5S- и 4S-PHK в одном и том же геле была предложена улучшенная ступенчатая система, состоящая из слоев 2,4%-ного и 6,8%-ного гелей [999].
Элсон и Джовин [339] с помощью ступенчатого градиента концентрации полиакриламидного геля разделили большое число олигодезоксирибонуклеотидов, полученных при ферментативном гидролизе чередующихся сополимеров дезоксиадени-ловой и дезокситимидиловой кислот, В этой системе нижний гель содержал 20% акриламида и 1,25% бис-акриламида. Буферная система также была неоднородной. Верхний электродный резервуар был заполнен буфером трис-НС1 (pH 8,2), а нижний — трис-глициновым буфером (pH 8,9). Верхний слой геля содержал буфер трис-НС1 (pH 7,2), а нижний слой — бу-
9ч 18ч
Рис. 121. Влияние объема пробы на разделение РНК при электрофорезе в экспоненциальном градиенте концентрации полиакриламидного геля (2—6%) Г876]. На гели А и Б наносили 50 мкл пробы, а на гели В и Г — 800 мкл. Через 9 ч (А и Б) и 18 ч (3 и Г) после начала электрофореза гели сканировали в УФ-свете» I — поглощение при 260 нм; II — поглощение при 260 ни контрольных (ненагруженных) гелей.
фер трис-НС1 (pH 9,0). В этих условиях разделялись все дез-оксирибонуклеотиды, содержащие от 3 до 30 мономеров.
Можно также с успехом использовать непрерывные линейные градиенты концентрации геля. В гелях с линейным градиентом концентрации от 2,0 до 10% 23S-PHK Е. coli разделялась на три зоны, каждая из которых была шириной около
1 мм [1124]. При электрофорезе в однородном 2,5%-ном геле тот же препарат давал одну диффузную зону.
Аналогичным образом путем электрофореза в гелях с линейным градиентом концентрации акриламида от 2,5 до 7,5% разделяют фрагменты ДНК ;[23, 626]. Помимо того что эта
система обеспечивает хорошее разрешение, она позволяет также определять молекулярные массы компонентов в диапазоне от 7• 104 до 14-106.
Миро и др. .[876] применяли гели с экспоненциальным градиентом концентрации полиакриламида, приготовленные в кварцевых трубках. Это дало возможность проводить прямое денситометрическое сканирование гелей. Чтобы обеспечить стабильность градиента концентрации акриламида во время полимеризации, создавали параллельный градиент концентрации глицерина. ТЕМЭД и персульфат добавляли в концентрациях обратно пропорциональных концентрации акриламида. Гели готовили на буфере, содержащем триэтаноламин, ацетат натрия и ЭДТА (pH 7,4). Электродные резервуары наполняли тем же буфером с добавлением глицерина, ДСН и дезоксихолата. Ядрышковые РНК из клеток HeLa наносили на гель в объеме 50 и 800 мкл. Если электрофорез продолжался в течение 9 ч, то разделение было лучше в пробе с объемом 50 мкл, однако через 18 ч в обоих случаях были получены одинаково хорошие результаты (рис. 121). Изучение кинетики электрофоретической миграции показало, что в градиентном геле разные виды РНК движутся с той же относительной скоростью, что и в однородном геле. При использовании экспоненциального градиента концентрации от 1,8 до 15% можно в один прием разделить все клеточные РНК и определить их молекулярные массы.
Недавно был описан принципиально новый метод избирательного разделения полинуклеотидов: аффинный электрофорез в геле [1011]. Полиакриламидные гели, содержащие поли-(1-винилурацил) или поли-(9-виниладенин) были получены путем полимеризации акриламида в присутствии указанных веществ. При электрофоретическом разделении нуклеиновых кислот в таких гелях важную роль играют спаривание оснований и более слабые стэкинг-взаимодействия.
ДВУХМЕРНЫЕ МЕТОДЫ РАЗДЕЛЕНИЯ ПОЛИНУКЛЕОТИДОВ
Олигонуклеотиды можно разделять путем электрофореза в гелях, содержащих мочевину, при pH 3,5 [296, 1074, 1075]. В этих условиях на электрофоретическую подвижность влияет как длина цепи олигонуклеотида, так и его нуклеотидный состав. Сочетание этого метода с обычным электрофорезом улучшает разделение полинуклеотидов со сравнительно небольшими молекулярными массами.
Было описано двухмерное разделение олигонуклеотидов, полученных при ферментативном расщеплении нуклеиновых кислот [297]. Первое разделение проводили в 8%-ном или 10%-ном геле (в зависимости от молекулярных масс разделяемых фраг-
ментов) при pH 3,5; во втором направлении использовали 16%-ный или 20%-ный гель (pH 8,0).
Двухмерная система электрофореза была применена также для разделения транспортных РНК [1232]. Первый этап осуществляли в 15%-ном полиакриламидном геле, содержавшем MES-буфер (pH 5,8) и мочевину. В этой системе транспортные РНК, выделенные из клеток Е. coli, разделялись на 15 зон. Разделение во втором направлении проводили в 16%-ном полиакриламидном геле, содержавшем трис, борную кислоту и ЭДТА [984]. Результаты двухмерного электрофореза такого типа приведены на рис. 122. Следует отметить, что после электрофореза при pH 5,8 транспортные РНК можно пометить прямо в геле радиоактивными аминокислотами, что помогает идентифицировать разделенные зоны.
