Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Описаны также другие двухмерные системы, позволяющие разделять транспортные РНК и полинуклеотиды, полученные путем ферментативного расщепления высокомолекулярных нуклеиновых кислот [395, 608].
1II.1.3. Электрофорез нуклеиновых кислот в полиакриламидно-агарозных гелях
Крупнопористые гели, используемые для разделения высокомолекулярных веществ, получают путем полимеризации разбавленных растворов акриламида. При этом образуются очень непрочные гели, механические свойства которых можно улучшить, добавив к ним агарозу.
Комбинированные гели готовят двумя способами [984].
1. Раствор, содержащий все компоненты, необходимые для образования геля, нагревают до температуры выше 35 °С, чтобы предотвратить застывание агарозы. Его выдерживают при этой температуре до тех пор, пока не закончится полимеризация полиакриламида, а затем охлаждают, чтобы вызвать застывание агарозы.
2. Гелеобразующий раствор охлаждают до комнатной температуры, вследствие чего агарозный гель образуется раньше, чем заканчивается полимеризация акриламида.
pH 5,8-------------------^
Рис. 122. Схема разделения
тРНК Е. coli методом двухмерного электрофореза в полиакриламидном геле [1232]. Стрелками указаны направления
электрофореза, а рядом приведены значения pH соответствующих буферных растворов*
Наиболее интенсивно окрашенные зоны на схеме обозначены точками.
При концентрации акриламида выше 3% можно применять оба метода; если же его концентрация ниже, то предпочтителен второй метод. Получение геля в этом случае проводят следующим образом.
Соответствующее количество смешанной с водой агарозы кипятят с обратным холодильником, интенсивно перемешивая, при 100 °С в течение 15 мин. Затем раствор охлаждают до 40 °С водой с температурой 30 °С (для предотвращения локального переохлаждения). Исходные растворы буфера, катализатора и акриламида смешивают в соответствующих пропорциях, смесь подогревают до 35 °С и к ней добавляют расплавленную агарозу до конечной концентрации 0,5%. После добавления персульфата смесь быстро наливают в форму и охлаждают до 20 °С. Затем в соответствующее место вставляют охлажденную на льду «гребенку» для формирования лунок и раствор оставляют примерно на 1 ч для полимеризации. Перед нанесением образца рекомендуется провести предварительный электрофорез для удаления остатков персульфата. Пикок и Дингман [984] использовали раствор мономеров, содержавший акриламид и бис-акриламид в соотношении 19: 1, а также ДМАПН в качестве катализатора (конечная концентрация 0,4%) и персульфат аммония (0,05%)* Последний обеспечивал образование геля с нужными свойствами и медленную полимеризацию акриламида.
Бурк и Нейлор i [ 154] предложили использовать ТЕМЭД вместо ДМАПН, так как, по их мнению, в гелях, образованных в присутствии ТЕМЭД, нуклеиновые кислоты разделяются лучше.
В комбинированных гелях, приготовленных одним из описанных выше способов [984], агароза содержится в такой концентрации, которая достаточна лишь для поддержания формы полиакриламидного геля. Таким образом, разделение нуклеиновых кислот в комбинированном геле зависит в основном от свойств полиакриламидного геля как молекулярного сита. Соответственно нуклеиновые кислоты имеют близкие электрофоретические подвижности в комбинированном и чисто полиакриламидном гелях.
С повышением температуры электрофоретическая подвижность двухцепочечных молекул возрастает, а одноцепочечных уменьшается. Возможно, это объясняется низкой точкой плавления двухспиральных участков, присутствующих в одноцепочечных молекулах. Вследствие плавления таких участков объем молекул увеличивается. Этот эффект и одновременное снижение вязкости среды влияют на подвижность одноцепочечных молекул в противоположных направлениях, поэтому уменьшение электрофоретической подвижности одноцепочечных нуклеино-
вых кислот можно обнаружить только в том случае, если данные соединения имеют относительно большие молекулярные массы [384]. Подвижность как одноцепочечных, так и двухцепочечных молекул нуклеиновых кислот является линейной функцией концентрации геля. Двухцепочечные нуклеиновые кислоты имеют более низкие коэффициенты задержки, чем одноцепочечные молекулы такой же молекулярной массы.
Дальнейшие исследования '[309] показали, что в диапазоне мол. масс'от 1-106 до 2*106 кольцевые двухцепочечные и кольцевые одноцепочечные молекулы нуклеиновых кислот можно разделить даже в том случае, если они имеют одинаковую молекулярную массу. Полинуклеотиды меньшей молекулярной массы (от 2-104 до 2*106) распадаются по подвижности на два класса. Один класс составляют одноцепочечные полинуклеотиды, образовавшиеся в результате диссоциации двухцепочечных молекул, а другой класс — линейные двухцепочечные и природные одноцепочечные полинуклеотиды, такие, как рибосом-ные РНК [308].
Еще одну возможность разграничения молекулярных форм нуклеиновых кислот дает окрашивание универсальным красителем «стэйнзолом» [308, 309]. Двухцепочечные РНК и ДНК окрашиваются этим красителем в синий цвет, тогда как окраска одноцепочечных РНК и ДНК (в том числе денатурированной ДНК) варьирует от пурпурного до сине-фиолетового цвета. Окрашенные зоны можно охарактеризовать по соотношению оптических плотностей при 560 и 520 нм. Для окрашенных зон двухцепочечных полинуклеотидов спектральное отношение ОП560/ОП520 составляет около 2,12; а для зон одноцепочечных молекул — около 1,20. Путем окрашивания «стэйнзолом> можно обнаружить до 0,01 мкг нуклеиновых кислот, однако определение спектрального отношения возможно только в том случае, если в зонах содержится не менее 0,1 мкг материала.
