Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Гааль Э. -> "Электрофорез в разделении биологических макромолекул" -> 149

Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.

Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул — М.: Мир, 1982. — 448 c.
Скачать (прямая ссылка): elektroforezvrazdeleniibiologicheskih1982.djvu
Предыдущая << 1 .. 143 144 145 146 147 148 < 149 > 150 151 152 153 154 155 .. 185 >> Следующая

с Л
Рис. 118. Влияние содержания бис-акрнламида в смеси мономеров на электрофоретическую подвижность ренатурированной 5S-PHK [1086]. Суммарная концентрация мономеров сохранялась постоянной и составляла 12,5% (I) и 18%.
(И).
Было показано, что длина пути, пройденного РНК при электрофорезе, находится в линейной зависимости от времени.
Квадрат ширины зоны представляет собой линейную функцию от количества нанесенной РНК, содержащейся в пробах с одинаковым объемом (рис. 116), что соответствует теоретическим предсказаниям. Практическое следствие, вытекающее из этого факта, состоит в том, что узкая зона, мигрирующая непосредственно перед широкой, может маскироваться последней.
Поскольку скорость диффузии зависит от концентрации присутствующего в зоне материала, скорость расширения каждой зоны должна зависеть также от суммарной нагрузки на гель. Наличие этого эффекта также доказано экспериментальным путем (рис. 117). В отличие от количества РНК объем образца может изменяться без существенного влияния на ширину зон.
Высокая концентрация буфера приводит к образованию более четких зон. Следует избегать применения разбавленных буферов (с молярностью ниже 0,01), так как в опытах с колонками биогеля было показано, что при низкой ионной силе буферного раствора РНК может связываться с полиакриламидным гелем. Оптимальная нагрузка зависит от ионной силы буфера и подвижности его аниона. Чем выше ионная сила буфера, тем больше РНК можно нанести. Поэтому при разделении
2,0 2,2 2,4 2,6 20 3,0
Содержание акриламида г% (массо/объем)
Рис. 119. Зависимость между максимальным количеством РНК, которое может быть воспринято гелем, и концентрацией ге>ля [981]. По оси ординат отложены максимальные количества суммарной РНК печени крысы, при нанесении которых на гель указанного диаметра не происходит растрескивания и усадки геля. Гели содержали 7% (объем/объем) глицерина. Отношение акриламида к этилендиакрилату было во всех случаях одинаковым {11:1 масса/ /объем). Максимально допустимую нагрузку для 2%-ного геля определяли путем экстраполяции. Каждая точка на графике представляет собой среднюю из трех определений, но разброс данных приведен только для гелей диаметром
8 мм.
нуклеиновых кислот в препаративном масштабе желательно использовать более концентрированные буферные растворы. В идеале буфер должен содержать какой-либо анион, подвижность которого была бы равна подвижности РНК. Вне всякого сомнения, наиболее подходящим в этом отношейии является анион хлорида.
Естественно, подвижность РНК зависит от концентрации геля. Для 5S-PHK существует линейная зависимость коэффициента задержки от квадратного корня общей концентрации мономеров. На подвижность 5S-PHK влияет также соотношение акриламида и б«с-акриламида (рис. 118).
Большинство приведенных выше выводов, вытекающих из экспериментальной работы Ричардса и Леканиду :[ 1086], по всей вероятности, применимо также и к электрофоретическому
разделению нуклеиновых ной массой. Однако при
12 3^5
Расстояние от старта, см
кислот с более высокой молекуляр-использовании разбавленных гелей следует принимать во внимание целый ряд дополнительных факторов. В мягких гелях, содержащих не более 2,6% акриламида, нанесение слишком большого количества материала приводит к растрескиванию верхней поверхности геля [981]. С увеличением поперечного сечения геля можно почти пропорционально увеличивать наносимое количество РНК. Разбавление образца также позволяет несколько увеличить максимальную нагрузку. Сходное действие оказывает относительный гиперосмос, вызьшае-мый добавлением в гель 2—10% глицерина, тогда как присутствие
0,5%-ной агарозы привадит к противоположному эффекту. Концентрация акриламида в мягких гелях также является одним из важных факторов, влияющих на максимально допустимое количество разделяемой РНК. На рис. 119 показана корреляция между максимальной нагрузкой и концентрацией геля.
От концентрации геля сильно зависит не только допустимая нагрузка, но и разрешение зон при электрофорезе (рис. 120). Так, например, для разделения 28S- и 18S-PHK можно применять гели, в которых концентрация акриламида не превышает 3% [777].
Хотя при электрофорезе в ге-
Рис. 120. Электрофорез РНК © гелях различной концентрации [777]. На каждый гель наносили 40 мкг РНК, полученной из полисом ретикулоцитов кролика. Концентрация геля составляла: 2,2% И), 2,4% (?). 2,6% (В), 3,0% (Г), 3,5% (Д), 5% (?), 7,5% (Ж).
лях нуклеиновые кислоты разделяются в основном в соответствии с их молекулярной массой, в некоторых случаях можно также разделить те или иные виды молекул, имеющих одинаковые размеры. Лёнинг [777] установил, что у дрозофилы, гороха и шпорцевой лягушки существует корреляция между подвижностью рибосомных РНК и их нуклеотидным составом. Различия в подвижности были невелики и нивелировались при добавлении в буфер 2 мМ ацетата магния.
Влияние на электрофоретическую подвижность вторичной структуры полинуклеотидов можно снизить или полностью устранить, применив условия, вызывающие денатурацию. Этого можно добиться, обрабатывая РНК перед электрофорезом формальдегидом [481] или используя гели, содержащие мочевину, при повышенной температуре [1070], а также путем проведения электрофореза в неводной среде [1226]. Такие методы позволяют точно определять размеры молекул и обеспечивают очень хорошее разделение различных ввдов РНК. Так, например, Форгет и др. [392] нашли, что при электрофорезе <по Гоулду и Хэмлину [457] мРНК глобина разделяется на две зоны, тогда как при электрофорезе в водной среде образуется одна широкая зона. Сходный метод был ‘использован в другой работе [667] при изучении разных ввдов мРНК глобина человека.
Предыдущая << 1 .. 143 144 145 146 147 148 < 149 > 150 151 152 153 154 155 .. 185 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed