Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Недавно описана усовершенствованная методика препаративного электрофореза рибосомных РНК на пластинах геля, содержащего 0,5%
720 мм
6 /им
Рис. 123. Схема и размеры простого прибора для препаративного разделения РНК методом электрофореза в геле, [618]. 1 — трубка из плексигласа; 2 — гель; 3 — шланг к насосу и коллектору фракций; 4 — отверстие.
агарозы и 2,4 и/о полиакриламида [218]. После проведения электрофореза в специально оборудованной камере гели сканируют в УФ-овете, а затем извлекают РНК из соответствующих участков геля (путем электроэлющги.
Методы препаративного электрофореза можно также использовать и для разделения нуклеиновых кислот. В принципе для электрофореза нуклеиновых кислот пригодно большинство типов приборов, которые применяются для препаративного электрофореза в геле (см. разд. 1.11.4).
Кроме того, созданы приборы, специально предназначенные для разделения нуклеиновых кислот. Малачинский [803] описал особый комплект приспособлений для элюции нуклеиновых кислот из гелей, содержащих 3% акриламида. Джэкобсон и Jlo-диш [617] предложили очень простой способ выделения небольших количеств 4S- и 5S-PHK путем электрофореза в 10%-ном полиакриламидном геле. Вблизи нижнего конца плексигласовой трубки высверливают два расположенных напротив друг друга отверстия, и в них вставляют шланги, через которые элюирующий буфер поступает в трубку и вытекает из нее. Простран-
ство между разделяющим гелем и пробкой из геля, находящейся в нижнем конце плексигласовой трубки, образует «камеру для элюции» (рис. 123). Нужную скорость подачи элюирующего буфера можно определить путем электрофореза окрашенного вещества (например, бромфенолового синего). При правильно подобранной скорости протекания буфера весь краситель должен быть перенесен в выводящий шланг. В таком приборе достигается четкое фракционирование нуклеиновых кислот, о чем свидетельствуют данные, полученные при повторном электрофорезе выделенных фракций; оказалось, что степень их чистоты составляет не менее 90%.
Шимада и др. [1182] сконструировали аппарат, позволяющий разделять РНК в количестве от нескольких микрограммов до миллиграммов. В этом аппарате можно применять и разбавленные гели, поэтому он пригоден для выделения веществ с большой молекулярной массой.
111.1,8. Микрометоды электрофоретического разделения нуклеиновых кислот
Описаны методы, позволяющие разделять РНК в количестве от 5-10-10 до 1 -10-8 г на пластинах геля размером 30X4X0,1 мм. Для разделения низкомолекулярных РНК был использован полиакриламидный гель [335], а для разделения рибосомных РНК — комбинированный полиакриламидно-агарозный гель [1099]. Разделенные зоны окрашивали акридиновым оранжевым или фотографировали в ультрафиолетовом микроскопе при 100-кратном общем увеличении. Метод обладает такой же высокой разрешающей способностью, как и обычный электрофорез нормального масштаба.
Нуклеиновые кислоты также разделяют в капиллярах объемом 1 —10 мкл [915, 1223, 1444], Таким путем можно анализировать 1—5 мг ткани, содержащей 0,1 мкг нуклеиновых кислот, Наилучшие результаты были получены при использовании очень крутых градиентов концентрации полиакриламидного геля, на нижнем конце которого достигалась концентрация 30— 50%. Добавление пиронина Y (конечная концентрация 0,02%) к слою буфера, покрывающего образец, позволяет визуально следить за разделением нуклеиновых кислот во время электрофореза. В микрометоде, так же как при электрофорезе в обычном масштабе, разделение улучшается, если в буфер добавляют ЭДТА. Следует, однако, отметить, что в присутствии ЭДТА пиронин не окрашивает нуклеиновые кислоты. После завершения электрофореза гели выдавливают непосредственно в красящий раствор через отрезок полиэтиленового шланга, при-
крепленный к концу капилляра (чтобы предотвратить разрушение хрупкого геля). Для окрашивания можно применять практически любой краситель, используемый для обнаружения нуклеиновых кислот. Гели, содержащие ДСН, требуют более длительного периода окрашивания (около 12 ч). Однако при этом наблюдаются потери нуклеиновых кислот. Более быстрого окрашивания можно добиться путем использования красящего раствора, содержащего 30% формамида, 10% уксусной кислоты и 0,2% метиленового синего или толуидинового синего. После окрашивания гелей в течение 1 ч избыток красителя удаляют, промывая их в 7,5%-ной уксусной кислоте.
111.2. Определение молекулярной массы полинуклеотидов
При нейтральных и щелочных значениях pH в полинуклеотидах отношение заряда молекулы к ее массе является постоянной величиной [1085, 1087]. Поэтому полинуклеотиды нельзя фракционировать на основе различий в их зарядах [940]. Введение в практику электрофореза поддерживающих сред, обладающих свойствами молекулярного сита, позволяет проводить фракционирование полинуклеотидов в зависимости от размеров их молекул. В ряде работ [778, 857, 1085] было показано, что электрофоретическая подвижность нуклеиновых кислот в полиакриламидном геле обратно пропорциональна их коэффициентам седиментации. Аналогичные данные были получены и при электрофорезе в агаровом геле [498]. Левицки и Сински [762] установили, что электрофоретическая подвижность полинуклеотидов линейно зависит от логарифма коэффициента седиментации (в единицах Сведберга). Поскольку коэффициент седиментации пропорционален квадратному корню из средней молекулярной массы нуклеиновых кислот, должна существовать обратная зависимость между относительной подвижностью и логарифмом молекулярной массы. Этот вывод был подтвержден экспериментальным путем [123, 778, 984, 1099].
