Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Галлоцианиновый алюмохром [486] взаимодействует с фосфатными группами нуклеиновых кислот, что приводит к равномерному окрашиванию различных РНК. Метод позволяет проводить и количественное определение разделенных нуклеиновых кислот.
Для окрашивания нуклеиновых кислот используют также 0,2%-ный раствор толуидинового синего О в 7—10%-ной уксусной кислоте. Обесцвечивания можно добиться путем повторных промываний геля в уксусной кислоте или с помощью электрофореза {704, 852, 1268]. Редди и Блэк [1067] показали, что для окрашивания двухцепочечных вирусных РНК этот краситель подходит больше, чем метиленовый синий или галлоциановый алюмохром.
Описан быстрый метод окрашивания для обнаружения нуклеиновых кислот после их разделения в разбавленных полиакриламидных гелях [1209]. Гели погружают на 2 ч в смесь равных объемов 2%-ной уксусной кислоты и 90%-ного этанола, а затем переносят в 1%-ную уксусную кислоту, содержащую 0,3% толуидинового синего. Через 4 мин гели промывают 2%-ной уксусной кислотой, содержащей 10% глицерина.
Марцинка [815] сравнил несколько красителей, применяемых для выявления нуклеиновых кислот, и сделал вывод, что для окрашивания РНК лучше всего использовать следующий метод. В смеси уксусной кислоты, метанола и воды (1:1:8 по объему) растворяют 0,5% пиронина Y и 1% ацетата лантана. В этом растворе гели выдерживают в течение 16 ч. Обесцвечивание фона проводят путем электрофореза в смеси уксусной кислоты, метанола и воды (1:2:17 по объему) или повторными промываниями гелей в нескольких сменах той же смеси. Окрашенные гели можно хранить в разбавленной уксусной кислоте (3—10%-ной) в течение нескольких лет. Описанный метод позволяет обнаруживать 0,01 мкг РНК. В идентичных условиях толуидиновый синий дает менее чистый фон, а акридиновый оранжевый — менее интенсивную окраску.
«Стэйнзол» растворяют в 100%-ном формамиде, доведенном концентрированной соляной кислотой до pH 7,3—7,4. Раствор, содержащий 0,1% «стэйнзола», хранят в темноте в холодильнике и перед употреблением разводят в 20 раз 50%-ным водным формамидом. Гели оставляют в этом растворе на ночь в темноте, а затем обесцвечивают, промывая их проточной водой. Из-за светочувствительности «стэйнзола» следует избегать прямого воздействия интенсивного света на раствор красителя и окрашенные гели. «Стэйнзол» образует окрашенные комплексы не только с нуклеиновыми кислотами, но и с другими компонентами, такими, как белки, полисахариды и т. п. По цвету эти комплексы отличаются от комплексов с нуклеиновыми кис-
лотами, окраска которых в свою очередь зависит от конформации рибо- и дезоксирибонуклеотидов. (Этот факт уже обсуждался в связи с разделением нуклеиновых кислот в комбинированных полиакриламидно-агарозных гелях; см. разд. III.1.3.) «Стэйнзол» используется в большинстве работ по электрофорезу в гелях, содержащих формамид. Однако в этом случае можно применядь и другие красители, например пиронин Y [1226] или метиленовый синий [392].
Описанные выше красители пригодны также для обнаружения ДНК и олигодезоксинуклеотидов. Так, толуидиновый синий О [339], пиронин Y '[475] и метиленовый синий [626] применяют для локализации ДНК в тех же условиях, в которых проводят окрашивание РНК. Для специфической идентификации ДНК можно проводить в геле реакцию с реактивом Фёль-гена или с дифениламином. В результате последней реакции в тех зонах, где находится ДНК, образуются синие полосы, которые при хранении геля в 33%-ной уксусной кислоте постепенно бледнеют.
Пептидил-тРНК тоже можно обнаруживать на электрофоре-граммах с помощью красителей, специфичных для белков, таких, например, как кумасси яркий синий [1016].
II 1.1.7. Препаративный электрофорез нуклеиновых кислот в геле
Во многих случаях разделение нуклеиновых кислот или их фрагментов проводят с целью получения материала для дальнейшего анализа.
РНК можно элюировать из соответствующих участков геля путем встряхивания кусочков геля с подходящим буфером или с помощью электроэлюции подобно тому, что делают для извлечения белков. Методы электроэлюции довольно трудоемки, особенно в тех случаях, когда такой операции приходится подвергать большое число участков геля. Элюцию буфером проводить значительно проще, однако при этом может происходить загрязнение нуклеиновых кислот некоторыми растворимыми компонентами геля.
Нейман и Хенри {910] для экстрагирования нуклеиновых кислот, разделенных в полиакриламидно-агарозном геле, применяли фенол. Измельченные участки геля суспендировали в
2 мл 0,1 М раствора ЭДТА в 0,1 М натрий-ацетатном буфере. К полученной суспензии добавляли 1 мл фенола, встряхивали смесь 3 мин при 60 °С, затем охлаждали и центрифугировали 5 мин при 880 xg. Диспергированные частицы геля собирались на границе раздела между двумя фазами — водой и фенолом. Нуклеиновые кислоты извлекали из водной фазы путем осаж-
цения этанолом. В другой работе [225] было установлено, что для количественного выхода тРНК, окрашенных метиленовым синим, очень важно, чтобы обесцвечивание было кратковременным. Нуклеиновые кислоты можно извлекать из соответствующих уча-стков геля путем гомогенизации 'последних в измельчителе тканей в 0,02 М глициновом буфере (pH 9,0) по методу Динера [299]. Частицы геля осаждают центрифугированием и несколько раз промывают. Остающиеся в растворе нуклеиновые кислоты очищают хроматографией на колонках с гидроксиапатитом. После элюции нуклеиновых кислот частицы геля можно отделить от раствора, отфильтровав их через бумагу ватман № 52 с помощью шприца [297]. Нуклеиновые кислоты, элюированные из геля, 'можно осаждать бромистым це-тилтриметилам'монием [1474].
