Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
В системах растворителей 6—10 полисахариды образуют комплексы с ионами металлов, поэтому их миграция зависит от структуры боковых цепей полисахаридов.
Ни одна из перечисленных выше систем не позволяет разделить за один раз все виды гликозаминогликанов. Для полного разделения гликозаминогликанов необходимы по меньшей мере два этапа: на первом этапе происходит разделение в зависимости от заряда, а на втором — в зависимости от структуры остова [426, 1409] (табл. 10). Интересно отметить, что у комплексов гликозаминогликанов с ионами цитилпиридиния электрофоретическая подвижность оказалась такой же, как у свободных молекул [426].
Хата и Нагаи [524] предложили использовать для разделения компонентов смеси гликозаминогликанов двухмерный электрофорез на листах ацетата целлюлозы (рис. 127).
Основной проблемой при анализе кислых полисахаридов является отделение хондроитинсульфата А от хондроитинсульфа-та С. Сено и др. [1167] показали, что указанные полисахариды удается разделить в ацетате кальция [1167], однако в этом случае из смеси нужно предварительно удалить гепарин и ке-ратансульфат, поскольку по подвижности в такой системе эти полисахариды очень сходны с хондроитинсульфатами.
Точный электрофоретический анализ гликозаминогликанов в микрограммовых количествах можно быстро провести на по-
Рис. 127. Двухмерный электрофорез гликозаминогликанов на пленках из ацетата целлюлозы [524]. ГП — гепарин, ГК—гиалуроноеая кислота, ДС — дер-матансульфат, Х4С — хондроитин-4-сульфат, Х6С — хондроитин-6-сульфат, КС — кератансульфат. Буферные системы: в первом направлении — 0,1 М пиридин — 0,47 М. муравьиная кислота (pH 3,0); во втором направлении — 0,1 М ацетат бария (pH 8,0).
лосках ацетата целлюлозы. Тем не менее некоторые исследователи применяют для этих целей агарозный [580], комбинированный полиакриламидно-агарозный [847] или полиакриламидный [553] гели.
Для выделения гликозаминогликанов в препаративном масштабе пригоден электрофорез в блоках ацетата целлюлозы (пе-викона или целлогеля) в любой из перечисленных выше систем.
С помощью электрофореза была показана гетерогенность препаратов гепарина, выделенного из слизистой свиньи [581] или из кожи крыс [582]. Большое число работ посвящено определению содержания полисахаридов в моче здоровых и больных людей, поскольку при патологии полисахаридный состав в моче может изменяться [528, 961]. В моче здоровых людей основными компонентами являются хондроитинсульфаты, в меньшем количестве в ней присутствует гепариисульфат ([445, 1278, 1411].
5 е
I
1
t
Относительное расстояьие ся старта
Рис. 128. Зависимость относительной подвижности кислых мукополисахаридов от молекулярной массы [554]. Длина пути, пройденного гепарином, принята за единицу. ХСА — хондроитинсульфат А, ХСВ — хондроитинсульфат В, ХСС— хондроитинсульфат С.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНОВ
Хилборн и Анастасиадис [554] нашли линейную зависимость между логарифмом молекулярной массы полисахаридов и расстоянием, пройденным ими при электрофорезе в 6%-ном полиакриламидном геле, содержащем 0,2 М фосфатный буфер (pH 11,5) и 0,25 М формиат натрия (рис. 128). Так как в разделяемых смесях гликозаминогликаны всегда присутствуют в виде изомеров, различающихся по заряду или размерам, относительная ширина электрофоретических зон может служить мерой их гетерогенности.
Мэтьюс и Деккер [832] определяли молекулярную массу гликозаминогликанов с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в 0,05 М фосфатном буфере (pH 7,5). Очищенные полисахариды подвергают электрофорезу в полиакриламидных гелях с концентрацией 3, 4, 5, 8 и 10%, а затем пройденные полисахаридами расстояния в этих гелях делят на длину пути, пройденного в 3%-ном геле полисахаридом с наименьшей в данной фракции молекулярной массой. Таким путем устраняется различие в электростатических силах, действующих на каждый тип молекул. Полученные величины наносят на график как функцию от логарифма молекулярной массы полисахаридов. Точность метода составляет 7—26%.
ОКРАШИВАНИЕ ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНОВ
Чаще всего для окрашивания гликозаминогликанов используют метод, в котором в качестве красителя служит алцчановый синий [525]. Гели или полоски пленок вымачивают в течение нескольких мин в 0,1%-ном растворе алцианового синего в 0,1%-ной уксусной кислоте. Избыток красителя удаляют промыванием в 300 мл 0,1%-ной уксусной кислоты в течение 10 мин. Для количественной оценки окрашенные зоны вырезают и из них элюируют краситель 5%-ным хлористым цетилпиридинием при 100 °С в течение 15 мин. Затем их еще выдерживают 15 мин при комнатной температуре, после чего в элюатах измеряют оптическую плотность при 615 нм. При нанесении гексозамина в количестве 0,5—6 нмолей наблюдается линейная зависимость между концентрацией гликозаминогликанов и количеством связанного красителя. В процессе элюции красителя полисахариды остаются связанными с ацетатом целлюлозы и их можно повторно окрасить. Метод позволяет обнаруживать менее 1 мкг гликозаминогликанов при ошибке около 10%.
